24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

fuchange918

木虫 (正式写手)

应助: 33 (小学生)
金币: 2368.4
红花: 4
帖子: 716
在线: 151.7小时
虫号: 1727732
注册: 2012-03-30
性别: GG
专业: 食用真菌学

[求助] Trizol 法怎么提取高质量RNA 已有5人参与

本人实验真菌用Trizol法提取RNA后，跑胶验证降解程度还可以忍受，但是污染方面很严重：OD260/280=1.5左右，OD260/230=1.0左右，后期需要做RACE
主要有一下问题：
（1）试验中哪些试剂需要预冷（4度还是-20℃），比如氯仿、异丙醇、75%乙醇
（2）每次异丙醇沉淀离心后，管壁上总是粘有和底部沉淀一样的东西，而且沉淀用DEPC处理水溶解时总是不能全部溶解，应该怎么解决？
（3）还有就这这么步骤中的放置时间，帮我看看有没有问题，是过长还是过短
本人RNA提取步骤：
1、细胞或组织加 Trizol 后，室温放置 5min，使其充分裂解。。
2、12,000rpm 离心 10min，弃沉淀。
3、按 200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，上下颠倒混匀后冰上放置5min。
4、4℃ 12,000g 离心 15min。
5、吸取上层水相，至另一离心管中
6、按 0.5ml 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，冰浴放置10min。
7、4℃ 12,000g 离心 10min，弃上清，RNA 沉于管底。
8、按 1ml 75%乙醇/ml Trizol 加入 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、 4℃ 8,000g 离心 5min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥 5-10min。注：RNA 样品不要过于干燥，否则很难溶解。
11、可用 30ul DEPC处理水溶解RNA样品

回复此楼

» 猜你喜欢

散金已经有68人回复
生物质超级电容器已经有0人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有192人回复
ALK5 高选择性小分子 LY-3200882：可放大合成路线与质控要点解析已经有0人回复
AM630（CAS 164178-33-0）：CB2 选择性配体的实验使用与供应要点已经有0人回复
ADC标杆分子T-DM1全解析：从结构设计到实验室应用的技术要点已经有0人回复
HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？已经有0人回复
His标签蛋白纯化怎么才能快？已经有0人回复
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析已经有0人回复
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用已经有0人回复
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点已经有0人回复

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

1楼 2014-09-05 14:41:53

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

大懒猫爱生物

铁虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 3
红花: 1
帖子: 16
在线: 18.7小时
虫号: 2943518
注册: 2014-01-22
性别: MM
专业: 植物生理与生化

引用回帖:

4楼: Originally posted by niil at 2014-09-05 15:56:04
所需氯仿乙醇异丙醇常温即可。
离心的时候4度，其他操作常温也没有问题的。
第6步，一般还是加入等体积的异丙醇来沉淀。
“每次异丙醇沉淀离心后，管壁上总是粘有和底部沉淀一样的东西，”跟离心时不平衡有关。 ...

请问为什么只有离心的时候要求是低温呢，在提取的时候常温不会导致RNA的降解吗？除了异丙醇沉淀外，其他步骤如果用涡旋可以吗，还是应该温和混匀？