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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr遇到问题，P出的条带总是比目的条带高
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张冰宝

新虫 (小有名气)

[求助] pcr遇到问题，P出的条带总是比目的条带高 已有3人参与

我的目的条带是3900bp，跑胶显示总是在5000bp处，且条带比较暗。我用的是50微升体系{引物各2ul，水是35ul，buffer5微升。dntp 4ul，模板1.5ul，酶0.5ul}
退火温度我试了55度，57度，59度。55度和57度条带较亮但均有引物二聚体。59度没有引物二聚体但是条带较暗。。。三个温度条带均在5000bp处。
请问各位高手，这个是我的目的条带吗？我该怎么解决呢
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1楼 2014-09-03 11:07:32
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-03 18:15:29
如果3个温度都扩增一致，只是亮度不一致，应该引物扩增不是非特异。
请核实，你设计的引物是否最开始时忘了吧内含子长度计算在内？
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2楼2014-09-03 11:27:24
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-03 18:15:36
如果你确定目标片段就是3900，那么就把扩增产物两端测序（不能测通，可以每端测几百bp）再和你的目标片段比较或者到NCBI比对看到底是不是你需要的
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3楼2014-09-03 11:29:55
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koujie1986

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-03 18:15:42
应该是目的条带，产物有可能带了一部分内含子序列。5kb的长片段条带亮度暗一点很正常，这跟Taq酶种类、活性有关。
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4楼2014-09-03 17:26:48
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2014-09-03 11:27:24
如果3个温度都扩增一致，只是亮度不一致，应该引物扩增不是非特异。
请核实，你设计的引物是否最开始时忘了吧内含子长度计算在内？

初学，不是很懂，请问一下如何确定自己是否把内含子计算在内？多谢
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5楼2014-09-04 10:10:12
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by koujie1986 at 2014-09-03 17:26:48
应该是目的条带，产物有可能带了一部分内含子序列。5kb的长片段条带亮度暗一点很正常，这跟Taq酶种类、活性有关。

如何确定我是否带了内含子序列呢？我用普通的酶和takara的酶P出来的都是一样的
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6楼2014-09-04 10:11:41
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
张冰宝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:33:39
你用什么模板？5 kb可能是质粒模板。
如果用基因组DNA扩增，可能是连内含子一起扩增出来
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7楼2014-09-04 11:17:22
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chenguestc

木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-09-04 10:10:12
初学，不是很懂，请问一下如何确定自己是否把内含子计算在内？多谢...

那你开始设计的引物的时候是如何设计的？参考序列是什么？
可以用设计引物的参考序列到NCBI网站上比对，然后就可以知道了
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8楼2014-09-04 15:10:59
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-09-04 11:17:22
你用什么模板？5 kb可能是质粒模板。
如果用基因组DNA扩增，可能是连内含子一起扩增出来

就是基因组 DNA.
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9楼2014-09-04 15:29:17
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by chenguestc at 2014-09-04 15:10:59
那你开始设计的引物的时候是如何设计的？参考序列是什么？
可以用设计引物的参考序列到NCBI网站上比对，然后就可以知道了...

我在genebank上查到我要的基因序列，然后用prime prime 5设计的引物。
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10楼2014-09-04 15:47:32
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