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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建基因文库的方法筛选到阳性克隆，克隆中插入的基因长为8000bp，如何找到目的基因？
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小科研女dow

木虫 (小有名气)

[求助] 构建基因文库的方法筛选到阳性克隆，克隆中插入的基因长为8000bp，如何找到目的基因？ 已有3人参与

各位虫子们，大家好，小虫今天提出一个长久困扰的问题，希望得到大家的建议，先谢过了~
最近做基因文库，采用的PUC19作为载体，将不完全酶切的片段插入该载体中后，转化大肠杆菌DH5α，经过筛选得到阳性克隆，将阳性克隆单菌落培养提取质粒后送去测序公司测序，得到一个片段为8000bp的结果，以下为后续工作中遇到的问题：
1、目的基因应该不至于是8000bp这么大，小虫认为实际的目的片段式这8000bp中的一部分，经过软件划分ORF做了几个阅读框的表达，但是均无活性。
2、PUC19不是表达型质粒，所以没有办法将筛选的重组质粒直接转化到Rosetta和BL-21中大量表达，得不到目的蛋白。
3、曾经见过有人对PUC19做过改造，可以用于表达蛋白，而不是仅仅用来克隆，但是自己经验欠缺，没有这方面的基础。
4、还有人说，可以采用可以启动表达的宿主菌，也只是听说，并未接触过。

楼主主要的目的是在这8000bp中寻觅到真正的目的片段，请问有什么好的意见吗？先谢过了!
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做出色的科研人
1楼 2014-08-28 17:05:27
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小科研女dow: 金币+20, ★★★很有帮助 2014-08-30 18:37:24
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小科研女dow at 2014-08-30 09:42:55
现在的打算是这样的，但是一步步的亚克隆该选择什么样的方法呢？之前确实想过可能是几个基因一起在起作用，但是8000的片段，比如采用2分法来做，层主觉得可以吗？有更明智的办法么？...

就是二分法，一步步来，有些蛋白是要3-4个在一起才能发挥作用，他们要形成四级结构的蛋白复合体

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8楼2014-08-30 15:56:51
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小科研女dow(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-29 20:47:19
8000bp？你是测通了吗？
“将不完全酶切的片段插入该载体中后”为什么是不完全酶切而不是完全酶切
还有质粒你跑电泳了吗 与与其的大小是否符合
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3楼2014-08-29 10:44:54
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小科研女dow

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by happydove at 2014-08-29 10:44:54
8000bp？你是测通了吗？
“将不完全酶切的片段插入该载体中后”为什么是不完全酶切而不是完全酶切
还有质粒你跑电泳了吗 与与其的大小是否符合

不完全酶切这个微生物的基因组，然后建文库。
8000bp是阳性克隆，送给公司公司给测通了
质粒大小正确。
请问有什么办法可以从这8000中缩短片段吗？
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做出色的科研人
4楼2014-08-29 13:19:21
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小科研女dow: 金币+15, ★★★很有帮助 2014-08-30 09:41:00
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-31 19:08:35
一步步做亚克隆，一点点缩短，不要一下就掂出来orf做表达，可能需要几个基因才有活性

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6楼2014-08-30 09:09:05
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