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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » microRNA实时定量PCR上游引物自身形成二聚物怎么办？
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beaubear

银虫 (初入文坛)

[求助] microRNA实时定量PCR上游引物自身形成二聚物怎么办？ 已有2人参与

感觉自行设计PCR引物已经很难了，何况RT-PCR要求更多；但碰上设计mir的RT-PCR引物，更是难上加难。。。
先吐槽一下，然后言归正传。
根据购买的试剂盒说明设计RT-PCR上游引物，直接将成熟miRNA序列中的U转换成T，但首先Tm值不符合要求。于是对5‘端修饰，加入适当GC，调整到合适Tm。采用PrimerSelect对引物进行检测，首先发现可能形成发卡结构，于是重新调整GC顺序，直到ok。然后发现，所得引物最大的弊端是形成自身二聚体，这需要改变原miRNA序列，于是陷入混乱。。。
出现这种情况，那成熟miRNA在PCR扩增时是不是也会自身形成二聚体？结果是否可靠，是偏大还是偏小呢？
求牛人解答~
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1楼 2014-08-21 13:19:30
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bwangel

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
beaubear: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-08-24 09:01:52
荧光定量引物要求比较高，要做扩增效果曲线的，建议还是设计好的引物，有二聚体会让结果值变小的
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5楼2014-08-22 10:20:39
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summerliehu

银虫 (小有名气)
引物设计的几个原则最好遵守。。。帮顶一下
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★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★欢迎访问【时间管理】版————管理时间，走向成功★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★
2楼2014-08-21 14:46:08
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beaubear

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by summerliehu at 2014-08-21 14:46:08
引物设计的几个原则最好遵守。。。帮顶一下

就是说我现在设计的还需要优化是吧。。。
O(∩_∩)O谢谢回复~
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3楼2014-08-21 17:25:30
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和一

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
beaubear: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-08-24 09:01:37
自己没有把握的话可以交给公司去做，你只需要告诉他们是哪一个miRNA就行了，这些都是免费的，你只需要花合成引物的钱
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2014-08-21 21:57:17
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