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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 急求关于粘端平端连接
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jing843

铁虫 (初入文坛)

[求助] 急求关于粘端平端连接 已有3人参与

由于目的基因和载体只能由一个酶切位点可用，所以只用这唯一的酶切位点切开载体和目的基因，一端平一端粘 的去连接。具体怎么做呐？请求帮助。
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1楼 2014-08-17 10:00:53
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-17 23:57:59
论坛里有方法，二次链接，中间多一步切胶回收步骤，你搜搜看

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2楼2014-08-17 10:35:25
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jing843

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-17 10:35:25
论坛里有方法，二次链接，中间多一步切胶回收步骤，你搜搜看

谢谢，那我目的基因设计引物时只加一个酶切位点，这样行吗？
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3楼2014-08-17 10:49:17
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

单切小心自连，用CIAP处理一下

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4楼2014-08-17 13:56:50
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jing843

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-17 13:56:50
单切小心自连，用CIAP处理一下

非常感谢！我还想问一下，如果我目的基因设计引物时两端都加上那唯一的酶切位点，也不粘端平端连接了，直接用这单一的酶切位点单切后与载体的单切胶回收产物连接，请问这么做可行吗？
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5楼2014-08-17 14:24:56
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
jing843(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-18 10:03:32
需要验证插入的正反向问题，另外载体自连需要注意

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6楼2014-08-17 14:37:28
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jing843

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-17 14:37:28
需要验证插入的正反向问题，另外载体自连需要注意

非常感谢！请问您知道双切后将一端补平应该怎么做吗？
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7楼2014-08-17 15:00:15
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jing843

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-17 14:37:28
需要验证插入的正反向问题，另外载体自连需要注意

就是用两个酶切位点去切载体，而只有一个酶切位点可以用，另一端补平，目的基因设计引物时是不是在序列后面加一个或两个碱基以防止后面的序列移码呐？
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8楼2014-08-17 15:29:08
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a50044758

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
jing843(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-18 10:03:44
NEB的T7连接酶，你可以看看，可以解决你的问题，T7连接酶只能连粘端，平端不能连，你可以第一步用T7连接酶连粘端，回收后，第二步用T4连接酶连平端.
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9楼2014-08-17 23:05:42
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jing843

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by a50044758 at 2014-08-17 23:05:42
NEB的T7连接酶，你可以看看，可以解决你的问题，T7连接酶只能连粘端，平端不能连，你可以第一步用T7连接酶连粘端，回收后，第二步用T4连接酶连平端.

我现在的问题是用两个酶切位点去切载体，将一个酶切位点的一端补平，请问应该怎么做呐？
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10楼2014-08-18 08:41:32
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