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落木潇潇sky

铁虫 (初入文坛)

[求助] 连接转化 已有4人参与

lz本科实验菜鸟一枚，现在在做茶花的its。现在遇到问题，所有的程序都按照说明书操作的，连接试剂是TAKARA的，生工的提取试剂盒，胶回收试剂盒，菌用的是DH5α。可是最后AMP上就是不长菌，感受态涂LB是长菌的。怀疑连接转化有问题，可是无从下手，求指教！
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一条实验狗
1楼 2014-08-17 09:57:49
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ncuduhan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
落木潇潇sky: 金币+1, ★有帮助 2014-08-28 09:58:06
说明连接的问题咯，你是连接到什么质粒上的？T-easy吗？还是其他的质粒？
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2楼2014-08-17 11:14:01
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yang_g_g

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
落木潇潇sky(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:31:36
连接时测一下产物含量，连接试剂盒换个新（反复冻融影响大），另外注意amp用量，可用实验室阳性菌作对照，看看长不长。
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3楼2014-08-17 12:39:42
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
怀疑是连接问题的话可以做一个对照，可以将没有经过酶切的载体做转化涂板看看是否能长出单克隆，若能长出来可能是连接出问题，可以适当延长连接时间或更换酶切位点，若不能长出单克隆说明载体有问题喽！
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
4楼2014-08-17 15:12:12
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Lylissa

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
落木潇潇sky(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:31:50
你所连接的重组质粒是否是抗氨苄AMP的，氨苄与LB培养基的比例一般为1：:1000，另外可能与你连接所用的酶切载体和片段浓度有关，酶切2ng的载体和1ng的片段后，在10ul的连接体系里，加2ul酶切载体和6ul酶切片段试试，另外做个空白对照吧，就是加2ul酶切载体和6ul ddH2O作为空白连接。    T4 DNA连接酶的话，连接4~6h就可以连上了，转化的时候避免反复用枪头吹打DH5α.
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5楼2014-08-17 16:07:11
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落木潇潇sky

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-08-17 11:14:01
说明连接的问题咯，你是连接到什么质粒上的？T-easy吗？还是其他的质粒？

takara的18T
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一条实验狗
6楼2014-08-28 09:56:21
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