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xuyh3000

铁虫 (初入文坛)

[求助] Hi-tail PCR 第一轮有条带，第二轮有至少一条亮度很高的条带，但是第三轮无条带。 已有1人参与

我一直在扩增转座子插入突变体侧翼未知序列，参考的方法是刘老师2007年发表的 High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences 文章中的Hi-tail PCR方法，随机兼并引物用的是文章中报道的。结果是第一轮有条带，第二轮90%以上会出现一条最亮的带，浓度很高，大小在1kb-2kb间（不知道是不是特异性的目标带），但是第三轮出现涂带，或是能看见几条亮度很弱的带，重复多次，结果相同，见附图，1 表示第一轮PCR，2 第二轮pcr，3 第三轮 pcr。也试过了换掉特异性引物，随机引物组合的方法，结果也类似。着急啊！困惑啊！不知道哪位做过Hi-tail PCR的高手指点下，为什么一直会有这样的结果？

Hi-tail PCR  第一轮有条带，第二轮有至少一条亮度很高的条带，但是第三轮无条带。
pcr 图.png
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1楼 2014-08-08 17:32:17
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快乐的小草

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我觉得你左边的三个，第三轮是有条带的，而且三轮的条带看上去是逐渐减少的。如果第三轮你觉得条带浅，可以割胶回收之后，再PCR一次。
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2楼2014-12-14 17:13:32
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coolthebest

新虫 (初入文坛)
楼主用刘耀光老师的方法鉴定出来了吗？我最近也在用刘老师的方法做，但是都没有目的条带，目前很着急，想跟你交流一下。
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相信每天都很好
3楼2015-12-22 11:35:29
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婷宝宝2013

银虫 (小有名气)
请问楼主解决了吗？能否传授一下如何扩增未知序列？我最近也在做，但都扩不出来
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4楼2018-05-03 14:52:11
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