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mmojf

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达不表达 已有6人参与

求助,刚开始做表达,目的是为了研究蛋白功能,但是在表达上就遇到了困难,RNA序列是1224bp,进行了在线稀有密码子分析和可溶性分析,结果如附件图:含有20几个稀有密码子,在大肠杆菌中“The input sequence has a 0.0 percent  chance of solubility  when overexpressed in  E. Coli.”;载体为PET28a,选择酶切位点分别为Ecor1和Hind3,表达感受态使用过BL21(DE3)和ROSETTA。蛋白不表达,应该怎样解决呢,求高手解答

原核表达不表达
可溶性.jpg


原核表达不表达-1
密码子.jpg
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dy_414

木虫 (正式写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-08-01 23:54:48
引用回帖:
12楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-07-31 20:03:13
那为什么同一个基因,全长连这个载体不表达,截掉一段后连这个载体就表达了?求相关与稀有密码子无关的文献...

我个人推断,首先是你truncate掉的序列疏水氨基酸比较多,所以原核表达不易;第二可能是跨膜区,(这个也算第一条);第三可能有Cys导致半胱氨酸易错配;第四就是这段序列的domain有baterial toxicity。
我坚信,rp是攒出来的
13楼2014-08-01 22:51:01
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查看全部 22 个回答

小小cool

金虫 (正式写手)

用别的载体试试

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2014-07-30 10:34:22
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
顶楼上!果断换表达载体和表达菌株
3楼2014-07-30 13:26:16
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
mmojf(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-31 08:56:18
不表达,实验方法没问题的话,有两个办法供选择:换其他载体和换其他表达系统。
祝你成功!
4楼2014-07-30 15:48:04
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