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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 哪位大虾帮忙分析一下real-time PCR的结果
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zb0806030

银虫 (小有名气)

[求助] 哪位大虾帮忙分析一下real-time PCR的结果已有2人参与

附图是我做结果，我用的Takara的Mix，每个线都是不同的引物，目的是想试一下我的引物是否好用。因为没有什么经验，不知道是引物有问题还是模板不好导致的溶解曲线和扩增曲线都不正常，哪位高手帮忙分析一下可能的原因，提点建议，谢谢啦！

哪位大虾帮忙分析一下real-time PCR的结果
1.JPG


哪位大虾帮忙分析一下real-time PCR的结果-1
2.JPG
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厚积薄发
1楼2014-07-29 15:36:40
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zb0806030(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-29 19:10:47
你这啥都没有，问题就大了，模板引物不好都有可能，这根本就没有扩增出东西来嘛，先做个半定量，确定一下引物和模板有无问题
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2楼2014-07-29 16:36:40
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zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-29 16:36:40
你这啥都没有，问题就大了，模板引物不好都有可能，这根本就没有扩增出东西来嘛，先做个半定量，确定一下引物和模板有无问题

这些引物用这个模板做过RT-PCR，能扩出条带，大概30cycles就能出来带了，有个别引物可能有杂带。但大部分都还是可以扩出来一条特异条带的，还有可能有其它原因吗？谢谢
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厚积薄发
3楼2014-07-29 19:50:04
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
zb0806030: 金币+2, ★有帮助 2014-07-30 09:46:28
引用回帖:
3楼: Originally posted by zb0806030 at 2014-07-29 19:50:04
这些引物用这个模板做过RT-PCR，能扩出条带，大概30cycles就能出来带了，有个别引物可能有杂带。但大部分都还是可以扩出来一条特异条带的，还有可能有其它原因吗？谢谢...

但是从你的扩增曲线和熔解曲线上看确实是没有扩增出东西来，不然的话熔解曲线最起码是有峰的，另：做RT-PCR的引物和做qPCR的引物设计上应该不同你应该知道吧 那么是否是你的加样体系或者退火温度存在问题呢？你这个情况 可能性太多 不好判断
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4楼2014-07-30 09:27:03
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zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-30 09:27:03
但是从你的扩增曲线和熔解曲线上看确实是没有扩增出东西来，不然的话熔解曲线最起码是有峰的，另：做RT-PCR的引物和做qPCR的引物设计上应该不同你应该知道吧 那么是否是你的加样体系或者退火温度存在问题呢？你这个 ...

我们得引物都是别人文献里用做real-time的引物，一般q-pcr的引物退火是不是都在60左右，因为它退火和延伸是一步？
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厚积薄发
5楼2014-07-30 09:48:27
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liweiwei0812

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先用qPCR的MIX做普通PCR，摸索一下条件。
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6楼2014-07-30 10:21:34
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zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-30 09:27:03
但是从你的扩增曲线和熔解曲线上看确实是没有扩增出东西来，不然的话熔解曲线最起码是有峰的，另：做RT-PCR的引物和做qPCR的引物设计上应该不同你应该知道吧 那么是否是你的加样体系或者退火温度存在问题呢？你这个 ...

附件是我今天做的RT-PCR，一共21对引物，每个泳道一对（30cycles），用的引物和模板与q-pcr一样，那从这个结果看模板应该没有问题，有个别引物特异性不太好。最下面一条marker是250bp。是不是就可以确定是引物的问题？或者引物不适合做q-pcr，或者引物退火不合适？那一般q-pcr的引物退火可调的范围都在多少度到多少度呢？谢谢啦！
哪位大虾帮忙分析一下real-time PCR的结果-2
2014-7-30.jpg
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厚积薄发
7楼2014-07-30 10:27:01
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zb0806030: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-30 13:54:49
引用回帖:
7楼: Originally posted by zb0806030 at 2014-07-30 10:27:01
附件是我今天做的RT-PCR，一共21对引物，每个泳道一对（30cycles），用的引物和模板与q-pcr一样，那从这个结果看模板应该没有问题，有个别引物特异性不太好。最下面一条marker是250bp。是不是就可以确定是引物的问 ...

首先从你的电泳图上来看模板和引物基本是没问题的，因为能扩增出东西来，杂带先不管那是你引物特异性不好，重新设计即可，但你定量熔解曲线扩增曲线看是没有扩增出东西来的，建议如下：将定量后的产物跑电泳（2%的胶）看有无条带；退火温度一般都是60°；模板梯度稀释：10倍，50倍，100倍，500倍，1000倍
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8楼2014-07-30 13:15:15
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zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-30 13:15:15
首先从你的电泳图上来看模板和引物基本是没问题的，因为能扩增出东西来，杂带先不管那是你引物特异性不好，重新设计即可，但你定量熔解曲线扩增曲线看是没有扩增出东西来的，建议如下：将定量后的产物跑电泳（2%的 ...

非常感谢您的帮助，我找到原因了，模板和引物都没有问题，是pcr过程设置的问题，我们得pcr是ABI的Stepone，结果设置里面选了加Rox，把这一项选为none后，扩增曲线和溶解曲线都正常了。
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厚积薄发
9楼2014-07-30 13:56:55
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songzuowei

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zb0806030 at 2014-07-30 13:56:55
非常感谢您的帮助，我找到原因了，模板和引物都没有问题，是pcr过程设置的问题，我们得pcr是ABI的Stepone，结果设置里面选了加Rox，把这一项选为none后，扩增曲线和溶解曲线都正常了。...

奥 不客气 难怪呢 不然实在是不好分析原因
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10楼2014-07-30 14:00:35
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