应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 哪位大虾帮忙分析一下real-time PCR的结果
111/2返回列表12下一页
查看: 2112  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zb0806030

银虫 (小有名气)

[求助] 哪位大虾帮忙分析一下real-time PCR的结果 已有2人参与

附图是我做结果，我用的Takara的Mix，每个线都是不同的引物，目的是想试一下我的引物是否好用。因为没有什么经验，不知道是引物有问题还是模板不好导致的溶解曲线和扩增曲线都不正常，哪位高手帮忙分析一下可能的原因，提点建议，谢谢啦！

哪位大虾帮忙分析一下real-time PCR的结果
1.JPG


哪位大虾帮忙分析一下real-time PCR的结果-1
2.JPG
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
厚积薄发
1楼 2014-07-29 15:36:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zb0806030(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-29 19:10:47
你这啥都没有，问题就大了，模板引物不好都有可能，这根本就没有扩增出东西来嘛，先做个半定量，确定一下引物和模板有无问题
赞一下 回复此楼
2楼2014-07-29 16:36:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-29 16:36:40
你这啥都没有，问题就大了，模板引物不好都有可能，这根本就没有扩增出东西来嘛，先做个半定量，确定一下引物和模板有无问题

这些引物用这个模板做过RT-PCR，能扩出条带，大概30cycles就能出来带了，有个别引物可能有杂带。但大部分都还是可以扩出来一条特异条带的，还有可能有其它原因吗？谢谢
赞一下 回复此楼
厚积薄发
3楼2014-07-29 19:50:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
zb0806030: 金币+2, ★有帮助 2014-07-30 09:46:28
引用回帖:
3楼: Originally posted by zb0806030 at 2014-07-29 19:50:04
这些引物用这个模板做过RT-PCR，能扩出条带，大概30cycles就能出来带了，有个别引物可能有杂带。但大部分都还是可以扩出来一条特异条带的，还有可能有其它原因吗？谢谢...

但是从你的扩增曲线和熔解曲线上看确实是没有扩增出东西来，不然的话熔解曲线最起码是有峰的，另：做RT-PCR的引物和做qPCR的引物设计上应该不同你应该知道吧 那么是否是你的加样体系或者退火温度存在问题呢？你这个情况 可能性太多 不好判断
赞一下 回复此楼
4楼2014-07-30 09:27:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-30 09:27:03
但是从你的扩增曲线和熔解曲线上看确实是没有扩增出东西来，不然的话熔解曲线最起码是有峰的，另：做RT-PCR的引物和做qPCR的引物设计上应该不同你应该知道吧 那么是否是你的加样体系或者退火温度存在问题呢？你这个 ...

我们得引物都是别人文献里用做real-time的引物，一般q-pcr的引物退火是不是都在60左右，因为它退火和延伸是一步？
赞一下 回复此楼
厚积薄发
5楼2014-07-30 09:48:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liweiwei0812

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先用qPCR的MIX做普通PCR，摸索一下条件。
赞一下 回复此楼
6楼2014-07-30 10:21:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-30 09:27:03
但是从你的扩增曲线和熔解曲线上看确实是没有扩增出东西来，不然的话熔解曲线最起码是有峰的，另：做RT-PCR的引物和做qPCR的引物设计上应该不同你应该知道吧 那么是否是你的加样体系或者退火温度存在问题呢？你这个 ...

附件是我今天做的RT-PCR，一共21对引物，每个泳道一对（30cycles），用的引物和模板与q-pcr一样，那从这个结果看模板应该没有问题，有个别引物特异性不太好。最下面一条marker是250bp。是不是就可以确定是引物的问题？或者引物不适合做q-pcr，或者引物退火不合适？那一般q-pcr的引物退火可调的范围都在多少度到多少度呢？谢谢啦！
哪位大虾帮忙分析一下real-time PCR的结果-2
2014-7-30.jpg
赞一下 回复此楼
厚积薄发
7楼2014-07-30 10:27:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zb0806030: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-30 13:54:49
引用回帖:
7楼: Originally posted by zb0806030 at 2014-07-30 10:27:01
附件是我今天做的RT-PCR，一共21对引物，每个泳道一对（30cycles），用的引物和模板与q-pcr一样，那从这个结果看模板应该没有问题，有个别引物特异性不太好。最下面一条marker是250bp。是不是就可以确定是引物的问 ...

首先从你的电泳图上来看模板和引物基本是没问题的，因为能扩增出东西来，杂带先不管那是你引物特异性不好，重新设计即可，但你定量熔解曲线扩增曲线看是没有扩增出东西来的，建议如下：将定量后的产物跑电泳（2%的胶）看有无条带；退火温度一般都是60°；模板梯度稀释：10倍，50倍，100倍，500倍，1000倍
赞一下 回复此楼
8楼2014-07-30 13:15:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-30 13:15:15
首先从你的电泳图上来看模板和引物基本是没问题的，因为能扩增出东西来，杂带先不管那是你引物特异性不好，重新设计即可，但你定量熔解曲线扩增曲线看是没有扩增出东西来的，建议如下：将定量后的产物跑电泳（2%的 ...

非常感谢您的帮助，我找到原因了，模板和引物都没有问题，是pcr过程设置的问题，我们得pcr是ABI的Stepone，结果设置里面选了加Rox，把这一项选为none后，扩增曲线和溶解曲线都正常了。
赞一下 回复此楼
厚积薄发
9楼2014-07-30 13:56:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

songzuowei

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zb0806030 at 2014-07-30 13:56:55
非常感谢您的帮助，我找到原因了，模板和引物都没有问题，是pcr过程设置的问题，我们得pcr是ABI的Stepone，结果设置里面选了加Rox，把这一项选为none后，扩增曲线和溶解曲线都正常了。...

奥 不客气 难怪呢 不然实在是不好分析原因
赞一下 回复此楼
10楼2014-07-30 14:00:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zb0806030 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 4/200 2026-08-23 19:34 by lXgU0RvNTDC9
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 19:22 by lXgU0RvNTDC9
[公派出国] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 7/350 2026-08-23 19:10 by lXgU0RvNTDC9
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 6/300 2026-08-23 14:21 by KM5EcsNQRBPn
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +3 process2012 2026-08-23 4/200 2026-08-23 12:54 by huixian257
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 9/450 2026-08-23 10:44 by IXZuIJ2Q7OVy
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 5/250 2026-08-23 04:07 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 4/200 2026-08-23 04:04 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:55 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 03:52 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 9/450 2026-08-23 03:04 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭