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蓝色泡沫321

银虫 (初入文坛)

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[求助] 质粒提不出来已有4人参与

我用的pUC-T载体连接我的目的基因后转导DH5a大肠里，测序结果说明成功转导，可是挑取单菌落进行质粒提取条带特别浅，分别用4ml和7ml菌液提取的，都不行，培养时也加入了新买的氨苄，应该不会长杂菌吧，如果用锥形瓶摇菌效果会不会好点呢

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1楼 2014-07-23 14:12:24

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usky_4

银虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

引用回帖:

6楼: Originally posted by 蓝色泡沫321 at 2014-07-24 07:30:41
我是直接用转化的大肠杆菌扩大培养后送去测序，剩下的菌液再划板的，这样做会导致质粒丢失吗？可是有人和我一样的顺序就做成功了呀。我之前都是用试管摇的，5ml 12h，可是效果不好...

正确顺序应该是转化-涂板-挑菌-提质粒-测序-摇菌-提质粒。

挑单菌落的意义在于提取单克隆，就是说你的质粒应该是同源的。如果你只是转化而不挑单菌落，那么你的菌液是多克隆，即使是通过抗性基因培养，你依然会有真阳性和假阳性菌。因为按你这样的做法，你的扩大培养菌里会含有：未转化菌，转化菌但有突变，转化菌但无突变（真正的目的产物）。就算你测序得出了基因片段，只能说你有目的产物，但是同样会有非目的产物，因为你“剩下的菌液”和你送测序的菌液是不同的。所以就算测序成功，你后来挑的单菌落也不一定就是克隆成功的。即使挑出了真阳性，并不代表你的真阳性菌就是你之前测序的，同样有可能会有突变等。总而言之，你测的和你挑的单菌落完全是两回事。有人成功只是运气好罢了，不知道你的实验步骤是谁设计的，这样做其实是非常不严谨的。

正确的方法是：
1. 转化感受态，我用的方法是冰浴30min-42°热击45s-冰浴3min-SOC培养基37°摇菌1h（无抗生素）
2. 涂板。转化时我一般用20ul左右感受态+200ul左右SOC培养基，取30-50ul左右涂LB+抗生素板。如果是可以蓝白斑筛选更好。37° 12-16h
3. 挑单菌落10-20个，菌液PCR。如果有蓝白斑筛选，挑白斑。跑胶找目的基因。
4. 根据3的结果，从阳性菌液中取5ul左右，摇菌5ml+抗生素，12-16h
5. 提质粒前，取850ul菌液，暂时放在4°冰箱。剩下的菌液提质粒，送测序。如果你不在乎多测几个，可以从第4步中的阳性菌液选至少4个摇菌提质粒送测序，因为有时候会有点突变，多测几个保证成功率。
6. 测序返回，就可以用测序正确的那个质粒了。同时，第5步中放冰箱的菌液，选测序正确的那个，取850ul，加150ul甘油，存放在-80°冰箱。以后你再需要这个质粒的时候，就可以拿出来刮一点点摇菌-提质粒就行了。

这样做可以保证，你用的质粒就是你测序正确的那个质粒，因为单菌落的话说明都是从同一个菌长出来的，所以是单克隆。除非在你摇菌的时候突变（概率很低），那么只要提出来的质粒和跟你测序正确的质粒都是一样的。