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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 连接转化问题
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馨-馨

银虫 (小有名气)

[求助] 连接转化问题已有6人参与

各位大神，小妹最近做电转化，平板上一直什么菌都不长，干干净净，不知道是什么原因啊。
背景条件:
1. 目的片段是用TAKARA公司的EX Taq 酶通过简并引物PCR，在通过胶回收纯化过后，测浓度114.99ng/ul，大小约1.5kb。
2.连接体系：takara 公司的T-18-Vector 取0.5ul，上述1中的目的片段取1ul, 3.5ul 无菌水，5ul 的Soultion I ，总体积10ul，16℃连接11h.
3. 10ul 连接体系加入到100ul DH5 α 感受态细胞中，电转，2500V。
4.加入600ul LB，37℃摇床1h。
5.倒板：200ul 固体培养基 Amp加 400ul, x-gal 加160ul, IPTG 加80ul.
6.涂板：涂2个板，每个300ul。
7.培养：37℃恒温培养12-16小时。
8.结果：培养过后，什么都不长，平板干干净净。
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1楼2014-07-16 12:29:45
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馨-馨

银虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-18 16:50:29
T载体和DH5α用化转就可以了。

电转不是比化转效率高么。
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13楼2014-07-24 12:30:10
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xuyunjian

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
馨-馨: 金币+1 2014-08-19 08:58:15
没长，您用的应该是大肠杆菌吧，我曾做过，但是长出白点了。大肠很好长的啊，您用的筛选培养基应该没错吧？您是不是按照公司给的操作要求进行的？会不会是在实验中感染噬菌体（不过我没遇到过，建议您做个对照组，您看它能否长）？会不会在操作中，涂布器未凉，将其烫死？
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相信自己，永不言弃
2楼2014-07-16 12:40:50
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馨-馨

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xuyunjian at 2014-07-16 12:40:50
没长，您用的应该是大肠杆菌吧，我曾做过，但是长出白点了。大肠很好长的啊，您用的筛选培养基应该没错吧？您是不是按照公司给的操作要求进行的？会不会是在实验中感染噬菌体（不过我没遇到过，建议您做个对照组，您 ...

我做的是电转化，进行蓝白筛选。你说的用涂布器烫死，这个是不可能的。
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3楼2014-07-16 14:25:09
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xuyunjian

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 馨-馨 at 2014-07-16 14:25:09
我做的是电转化，进行蓝白筛选。你说的用涂布器烫死，这个是不可能的。...

我做过，不过不是电转化，，我也进行了蓝白筛选。您这种问题，可能是没转化成功，是不是电压问题？我也不太知道。
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相信自己，永不言弃
4楼2014-07-16 14:33:32
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