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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 求助毕赤酵母转化问题
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baicai734

禁虫 (小有名气)
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1楼 2014-07-15 21:17:14
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whove2012

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-16 20:16:05
1.线性化后的浓度一定要测，没有分析仪就和marker比亮度，至少得做一次浓缩，最后线性化片段添加量为5ug—10ug，10ul的体系你的线性化片段浓度至少得500ng/ul，不然转化效率不高。
2.这种传统电转化感受态制备只适 ...

我们也是做这个，毕赤酵母的转化表达，用的是pPICZαA质粒，单菌落长不出来，请问LiCl/DTT法制备电转化感受态法的具体步骤是什么？可以发给我吗？
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9楼2014-10-20 21:03:41
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2014-07-16 08:36:29
baicai734: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-07-16 17:33:28
1.你做转化的时候加了多少的线性化DNA？浓度多大
2.你的感受态是用什么方法制的，电转化后的显示器上的参数如何？
3.你YPDS的转化子大概多长时间长出来的？菌落颜色是否发青发红还只是有些发黄？打开平板有能闻到什么味道？挑菌的时候有没有发粘？
4.博莱霉素是新买的还是以前用过的？平时如何存放的？倒好的平板放的时间长不长，有没有避光保存，你转化后有没有直接涂未添加基因的感受态细胞来测试你的平板的抗性？
个人感觉YPDS上的单克隆并不一定是杂菌，有些当时略微泛黄的菌落时间长了慢慢就变白了，可以划个线，至于pcr验证最好还是提基因组PCR，酵母的菌落PCR远远不如细菌灵敏。
5.至于MD更容易染菌这完全没有根据，毕竟染不染菌还是主要看操作，而且9K的缺陷性初筛本来筛选效率就远高于抗性筛选，不过假阳性也不少的。一切还要看G418复筛的结果。
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大家相互帮助哈
2楼2014-07-15 23:58:02
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baicai734

禁虫 (小有名气)
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3楼2014-07-16 17:53:40
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-26 21:43:20
引用回帖:
3楼: Originally posted by baicai734 at 2014-07-16 17:53:40
1.因为我们实验室没有DNA分析仪，用紫外测定有太耗费了，所以我提取的时候已经是尽量把浓度增大了，这次做的浓度就是和PIC9k连接的质粒一样浓度，作为对照；
2.我是基本按照说明书的方法制备的感受态，就是水洗， ...

1.线性化后的浓度一定要测，没有分析仪就和marker比亮度，至少得做一次浓缩，最后线性化片段添加量为5ug—10ug，10ul的体系你的线性化片段浓度至少得500ng/ul，不然转化效率不高。
2.这种传统电转化感受态制备只适合转9K，而抗性筛选的Zeocin系列载体这种感受态转化效率很低，再加上你浓度估计也不够，那转化子肯定极少了，2—3天能长出来的估计有可能是，7-8天的平板30度下博莱霉素都不行了没有完全杀死的酵母长出来那很正常的，你把这些一个星期后长出来的再重新扎个平板估计又张不出来了。你可以试试LiCl/DTT法制备电转化感受态法，效果比传统法要好。酵母OD=1.0-1.2的时候才适合制备感受态
3.放点5ms差不多，如果能达到10ms更好，放电后最好迅速加入YPDS进行复苏，复苏时间可以适当延长。复苏后可以低速离心一下，去掉些上清适当浓缩一下菌液再进行涂板
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大家相互帮助哈
4楼2014-07-16 20:16:05
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