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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » 关于EMSA实验的一些问题
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xy656691

金虫 (正式写手)

[求助] 关于EMSA实验的一些问题 已有2人参与

1、我合成的探针是在5‘端标记的生物素，合成好的是单链。那么在PCR上退火使两条探针形成双链之后是直接使用PCR产物进行下步实验还是对PCR产物进行纯化之后再使用？
2、我使用的试剂盒是Throme的，实验步骤里说要使用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，请问这个怎么配制？由于没有加入SDS，在电泳的时候要考虑蛋白自身的电荷吗？（如何保证蛋白电泳时的方向）
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1楼 2014-07-10 15:33:10
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cyb1221

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhouxiaohan at 2014-07-16 10:17:19
1.探针需要纯化后再使用。
2.6%非变性胶配方
   30%Acr-Bis(29:1)  2.4ml
   5xTBE                 2.4ml
   ddH2O                7.2ml
   10%AP                200ul
   TEMED                10ul

请问EMSA探针互补的两条链都要加上生物素标记吗？本人小白一个，第一次设计，很懵········希望能不吝赐教！谢谢！
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成功不是偶然，失败不是命运！加油！
13楼2018-05-03 11:08:32
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zhouxiaohan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
xy656691(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-16 19:48:58
1.探针需要纯化后再使用。
2.6%非变性胶配方
   30%Acr-Bis(29:1)  2.4ml
   5xTBE                 2.4ml
   ddH2O                7.2ml
   10%AP                200ul
   TEMED                10ul
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2楼2014-07-16 10:17:19
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xy656691

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhouxiaohan at 2014-07-16 10:17:19
1.探针需要纯化后再使用。
2.6%非变性胶配方
   30%Acr-Bis(29:1)  2.4ml
   5xTBE                 2.4ml
   ddH2O                7.2ml
   10%AP                200ul
   TEMED                10ul

谢谢，探针只有25bp大小，怎么纯化呢？一般的PCR纯化试剂盒只能纯化100bp以上的。
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3楼2014-07-16 17:38:38
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zhouxiaohan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xy656691: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 很好谢谢 2014-07-18 10:49:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by xy656691 at 2014-07-16 17:38:38
谢谢，探针只有25bp大小，怎么纯化呢？一般的PCR纯化试剂盒只能纯化100bp以上的。...

只能用小片段回收试剂盒。一般的回收试剂盒回收不回来。我们用的是QIAEN的。
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4楼2014-07-17 10:16:42
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