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hajierlove

铜虫 (正式写手)

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[求助] 普通PCR遇到的问题，求助大神们已有6人参与

扩全长基因，基因大小825bp。八个温度梯度（52.5-54）,上下游引物Tm值分别为47.1、51.6、选用这个温度是因为之前梯度PCR未出来条带，在53度有杂带。图片如下，我应该怎么继续优化条件，虫虫们指导一下。谢谢啦

20140630-2_副本.jpg

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踏实

1楼 2014-07-02 13:16:18

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hajierlove

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10楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-04 14:56:15
你最下面的引物二聚体也太亮了，引物少加点，看引物问题不是很大，关键是用什么做的模板，质粒的话很容易就扩出来了，基因组或者cDNA的话关键是要保证模板质量，10倍稀释后退火温度用55°扩扩看

cDNA,只是表达量有点低。我再试试

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踏实

12楼2014-07-04 21:42:42

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hajierlove

铜虫 (正式写手)

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2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-07-02 13:51:01
应该是引物设计的不好，引物的Tm值太低。关于53℃有杂带的问题，有几个方面减少非特异性扩增，一方面采用热启动酶，另外可以添加一些PCR添加剂，如甜菜碱，DMSO等；还可以采用降落PCR的方法减少非特异性扩增。最好将 ...

扩全长，避免发夹结构，这个引物差不多只能这样啦。要不就出现发夹结构了

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踏实

3楼2014-07-02 13:55:22

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