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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » southern杂交--以含有探针的质粒杂交，为什么能杂出两条带。
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tewithte

新虫 (初入文坛)

[求助] southern杂交--以含有探针的质粒杂交，为什么能杂出两条带。 已有1人参与

杂交是使用了含有探针序列的质粒进行杂交对比，质粒和探针上都是应该没有酶切位点的，但是杂出了两条带，而且有一条特别亮，位置大约在500-1000bp左右，是不是浓度很高的DNA也可以非特异性杂交上？用的是罗氏DIG试剂盒。。
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1楼 2014-07-01 22:24:04
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bingbing2001

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-07-02 12:26:37
gyesang: 应助指数+1 2014-07-15 22:24:50
你给的信息太少，不知道该怎么帮你。
既然用质粒杂交，应该考虑到质粒的三种不同形态，可能位置会不同，可以考虑用酶切后的质粒杂交。
不知道能否解决你的问题。
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2楼2014-07-02 08:45:35
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wopopwz123

捐助贵宾 (小有名气)
你好，你这个问题很明显，如果是质粒与探针进行杂交的话，会出现3条带，线性、环形和开环的三个结构。如果是酶切好的，应该会出现一条带，但是你的酶切质粒是否纯化？如果纯化不干净，还会有这样的情况。过几天我会讲一个视频来说一下southern，各种各样的问题都会在里面讲，我经常做分子杂交。
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3楼2014-07-29 02:15:31
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豆豆龙9052

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wopopwz123 at 2014-07-29 02:15:31
你好，你这个问题很明显，如果是质粒与探针进行杂交的话，会出现3条带，线性、环形和开环的三个结构。如果是酶切好的，应该会出现一条带，但是你的酶切质粒是否纯化？如果纯化不干净，还会有这样的情况。过几天我会 ...

我做的是斑点杂交，探针用的是随机引物法，也是用罗氏的kit I ，用构建的质粒PCR产物来标记，目的片段为689bp左右，后来做了很多次都是只能检测到质粒，阳性样品无法检测到，愁苦~~
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4楼2014-07-30 10:00:07
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bxyoung

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wopopwz123 at 2014-07-29 02:15:31
你好，你这个问题很明显，如果是质粒与探针进行杂交的话，会出现3条带，线性、环形和开环的三个结构。如果是酶切好的，应该会出现一条带，但是你的酶切质粒是否纯化？如果纯化不干净，还会有这样的情况。过几天我会 ...

请教一下，我们最近做suothern一直是样品杂不出带，阳性能杂出，我们一直怀疑是酶切不够好，我们用的是：DNA20ug，酶1/10总体积，buffer1/10总体积，ddH2O补齐500ul。请问你的酶切体系是怎么样的？还有你的探针是随机标记的还是PCR标记的？
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天道酬勤
5楼2014-10-20 09:16:05
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wopopwz123

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bxyoung at 2014-10-20 09:16:05
请教一下，我们最近做suothern一直是样品杂不出带，阳性能杂出，我们一直怀疑是酶切不够好，我们用的是：DNA20ug，酶1/10总体积，buffer1/10总体积，ddH2O补齐500ul。请问你的酶切体系是怎么样的？还有你的探针是随 ...

你邮箱是多少，我给你发一个过程资料
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6楼2014-10-20 13:47:52
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bxyoung

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wopopwz123 at 2014-10-20 13:47:52
你邮箱是多少，我给你发一个过程资料...

好的，谢谢！bxyoung@163.com
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天道酬勤
7楼2014-10-21 10:18:11
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PerfectAngel

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wopopwz123 at 2014-07-29 02:15:31
你好，你这个问题很明显，如果是质粒与探针进行杂交的话，会出现3条带，线性、环形和开环的三个结构。如果是酶切好的，应该会出现一条带，但是你的酶切质粒是否纯化？如果纯化不干净，还会有这样的情况。过几天我会 ...

你好，我想问一下，做探针时必须得用质粒吗？还有就是探针做好后要怎么保存呢？第一次做，以前实验室也没有人做过，急死了。。。。
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8楼2015-04-09 15:18:16
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wopopwz123

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by PerfectAngel at 2015-04-09 15:18:16
你好，我想问一下，做探针时必须得用质粒吗？还有就是探针做好后要怎么保存呢？第一次做，以前实验室也没有人做过，急死了。。。。...

哦 你们探针才用什么方法进行合成的？PC还是化学反应法。我QQ2712209254有问题可以咨询我
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9楼2015-04-09 22:31:36
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白日做梦123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 豆豆龙9052 at 2014-07-30 10:00:07
我做的是斑点杂交，探针用的是随机引物法，也是用罗氏的kit I ，用构建的质粒PCR产物来标记，目的片段为689bp左右，后来做了很多次都是只能检测到质粒，阳性样品无法检测到，愁苦~~...

我也是这种情况 请问你的问题解决了吗
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10楼2015-06-21 09:09:43
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