应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 做RACE老是出现非特异扩增，求助！
52/1返回列表
查看: 2352  |  回复: 21
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

青青草allan

银虫 (小有名气)

[求助] 做RACE老是出现非特异扩增，求助！ 已有3人参与

我在做RACE扩增一个基因的全长cDNA，设计的基因特异引物可以扩增出中间的重叠片段（经测序确证），但是5‘和3’RACE总是做不出来。根据已经扩增出的中间片段，设计了5‘和3’RACE引物，能扩增出条带，Maker指示的片段大小也和目的片段大小差不多，但是经切胶回收，连接转化，挑斑，送菌样测序后测回来的序列在NCBI上比对后，发现相似性较高的老是一些别的东西的序列（如某个病毒的基因组，或者是某个东西的核糖体蛋白）。也尝试换过引物，但是要么扩不出东西，要么是空载体，要么是上述那种情况。我用的是试剂盒是SMART™ RACE cDNA Amplification Kit。请有经验的高人指点，不胜感激！

[ Last edited by 西门吹雪170 on 2014-6-28 at 12:44 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
爱出者爱返，福往者福来
1楼 2014-06-28 11:47:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by lma223 at 2014-07-10 17:03:05
为了保障你的RACE能够特异性，请设计多条引物，有种方法叫做 Asymetric PCR with nested primer。即，先用你的specific 引物1 单引物扩增10-50个cycle，然后再用新的specific 引物2 （引物2的位置应该在引物1的上游 ...

好的，谢谢高手指点
赞一下 回复此楼
爱出者爱返，福往者福来
15楼2014-07-11 09:21:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 22 个回答

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2014-06-28 19:50:49
你的双链做的怎么样？RNA质量好不好？特异引物设计的退火多少度？测序后能不能拼接？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
2楼2014-06-28 12:07:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-28 12:07:43
你的双链做的怎么样？RNA质量好不好？特异引物设计的退火多少度？测序后能不能拼接？

我们实验室是统一提的RNA，做的cDNA，也有别的人在用，也有做出来别的基因的全长的，应该没有问题。避免反复冻融，我们做的5‘和3’cDNA是用小PCR分装的，一直放在-20度，现在已经放了有两个多月。我是在做5个基因的全长，特异引物设计的退火温度都不一样啊，都做出来了，有的800-1000bp的基本上测序的时候都让公司给双向测通拼接了，小于800bp的基本都是让正向测序，没有拼接过。有影响吗？谢谢回帖！
赞一下 回复此楼
爱出者爱返，福往者福来
3楼2014-06-30 09:09:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
青青草allan: 金币+1, ★有帮助 2014-07-11 21:37:04
青青草allan: 金币+1, ★有帮助 2014-07-11 21:37:52
引用回帖:
3楼: Originally posted by 青青草allan at 2014-06-30 09:09:15
我们实验室是统一提的RNA，做的cDNA，也有别的人在用，也有做出来别的基因的全长的，应该没有问题。避免反复冻融，我们做的5‘和3’cDNA是用小PCR分装的，一直放在-20度，现在已经放了有两个多月。我是在做5个基因 ...

你们的双链cDNA做的好不好？race获得的序列能否与已知片段拼接起来？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
4楼2014-06-30 09:17:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 22 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 国自然评审意见 +6 wangmingqi 2026-08-28 7/350 2026-08-28 18:20 by Frank0820
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-28 17:09 by winsaint
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +11 Kittylucky 2026-08-27 12/600 2026-08-28 16:26 by lyxiaomc
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +3 bud_bud 2026-08-27 6/300 2026-08-28 11:53 by bud_bud
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +12 晴天加油 2026-08-26 13/650 2026-08-28 11:32 by skyjudy
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[文学芳草园] 梦想 +3 myrtle 2026-08-26 3/150 2026-08-27 10:01 by angelyueyi
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭