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hbl215

金虫 (文坛精英)

[求助] 关于噬菌体展示技术的一些问题 已有4人参与

最近在学习基因重组跟噬菌体展示技术这一块，完全小白一枚，再看文献中有几个问题想请教：
1.从杂交瘤细胞中提取总RNA反转录成CDNA，再设计带有poly-C尾巴的anchor引物作为5’端引物扩增抗体的可变区，这里的5’端引物是不是仅靠这些G-C配对就可以延伸呢，如果是的话至少需要多少碱基配对就可以保证延伸？
2.3’端的基因特异性引物是以FR4为模板设计的么，还是其他的设计方案？或者3’端引物以恒定区序列为模板设计，先扩增出整个重轻链基因，再通过基因序列比对，除去一样的恒定区序列，剩下的就是可变区序列？
3.在噬菌体库的富集筛选中，为什么富集到最后一轮，库容量越来越大呢？我的理解是筛去原始库中的一些不结合的噬菌体后，库应该越来越小呀，最后浓缩出高结合力的精华呀。
希望做过的懂得的帮我解释一下，小白不胜感激！
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1楼 2014-06-24 11:07:20
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hbl215

金虫 (文坛精英)
高手在哪里呀，等待解答
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4楼2014-06-25 16:16:11
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wersdu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hbl215: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-06-26 09:30:29
第三个问题，一般在第一轮、第二轮富集过程中，库容不会有明显的增加，第三轮富集库容一般会增加2-3个数量级，是与抗原结合的噬菌体大量拷贝，测序后会发现大量重复克隆。
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5楼2014-06-26 08:48:02
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hbl215

金虫 (文坛精英)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wersdu at 2014-06-26 08:48:02
第三个问题，一般在第一轮、第二轮富集过程中，库容不会有明显的增加，第三轮富集库容一般会增加2-3个数量级，是与抗原结合的噬菌体大量拷贝，测序后会发现大量重复克隆。

哦，明白了，那在每一轮的筛选，是把整个库全部筛，还是扩增后取部分出来筛，其余的保存？同样，最后一轮后测序也是扩增后选取部分测序么？
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6楼2014-06-26 09:29:58
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whui

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
hbl215: 金币+50, ★★★很有帮助 2014-06-27 09:31:34
关于5‘引物，一般是用leader 或者FR1的保守序列来设计兼并引物使用。不知道你所说的polyC具体是指什么？mRNA帽子结构？
3’端引物，通常做FAB库，会将恒定区CH1/CK的末端来作为引物使用。对于scFv库，可以CH1/CK的恒定区起始端做一扩引物，再用FR4作为二扩引物，当然也可以用FR4序列直接做引物来扩增。
和CDR的定义不同，恒定区序列已经有了严格的定义，你可以找文献或IMGT看看。
富集筛选，顾名思义当然是越来越富集了：） 前面已经有人提过了，你可以理解为：筛选剩下的克隆被特异性富集，此时的库容只代表富集的程度，而非抗体多样性了。
看你介绍，应该是做鼠抗，现在应经有很多现成的引物集可以用，你可以查查文献。这里推荐一篇经典的
Efficient amplification and direct sequencing of mouse variable regions from any immunoglobulin gene family

另外，你是本科还是硕士，这种应用性很强的课题最好有师兄师姐带着做，会快捷很多。
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7楼2014-06-26 14:39:38
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