应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 与PMD-19T连接问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
53/1返回列表
查看: 2703  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
【悬赏金币】回答本帖问题，作者小冀-将赠送您 62 个金币
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

[求助] 与PMD-19T连接问题 已有6人参与

用PMD-19T载体与我的目的基因片段（3.3kb）链接，之前用高保真酶进行PCR扩增后通过加A试剂盒进行加A尾，之后热击转化，涂布后长出菌落，但是提质粒鉴定后发现载体自连（单双酶切条带一样，只有一条，有一个不一样的，但单切有出现两条条带）；后来用一步克隆试剂盒进行连接，但涂布后没有菌落，一直不知道是什么原因，请高人指教···
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
···
1楼 2014-06-17 08:56:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ltf329395464

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

这有啥稀奇的，目的片段超过3000去连TAKARA的T载体不是去找虐么，阳性率老低了。
赞一下 回复此楼
ONLY I CAN !
22楼2015-01-22 14:45:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 23 个回答

Neo2000

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小冀-: 金币+1 2014-06-17 10:51:49
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-17 15:08:09
平末端的再加A进行ta克隆，效率本来就很低，你可以考虑用taq，循环数低一点，多扩一点，回收时少加点水浓缩，连接时不加水多加PCR产物，试试，祝好

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
2楼2014-06-17 09:40:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 09:40:07
平末端的再加A进行ta克隆，效率本来就很低，你可以考虑用taq，循环数低一点，多扩一点，回收时少加点水浓缩，连接时不加水多加PCR产物，试试，祝好

我用Ex-Taq酶做过一次，片段是P出来了，而且都说用它P的都会存在A尾，所以就直接连了，鉴定时还是没有连上···
赞一下 回复此楼
···
3楼2014-06-17 10:51:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小冀- at 2014-06-17 10:51:12
我用Ex-Taq酶做过一次，片段是P出来了，而且都说用它P的都会存在A尾，所以就直接连了，鉴定时还是没有连上···...

那说明问题出在ta克隆这一步，18t是很一般的t载体，建议用pGEM T Easy，NEB的连接酶

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
4楼2014-06-17 12:11:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 23 个回答
不应助 确定回帖应助 (注意：应助才可能被奖励，但不允许灌水，必须填写15个字符以上)
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿北京理工大学本科211材料工程294求调剂 +7 mikasa的围巾 2026-03-28 7/350 2026-03-29 10:21 by ms629
[考研] 0856材料化工调剂 总分330 +14 zhubinhao 2026-03-27 14/700 2026-03-29 10:01 by Sjndkwm
[考研] 298求调剂 +4 种圣赐 2026-03-28 4/200 2026-03-29 08:42 by q1092522407
[考研] 356求调剂 +3 gysy?s?a 2026-03-28 3/150 2026-03-29 08:26 by fmesaito
[考研] 085600 材料与化工 329分求调剂 +11 Mr. Z 2026-03-25 11/550 2026-03-29 08:14 by 无际的草原
[硕博家园] 招收生物学/细胞生物学调剂 +4 IceGuo 2026-03-26 5/250 2026-03-29 01:25 by griffith2014
[考研] 一志愿武汉理工，总分321，英一数二，求老师收留。 +7 nnnnnnn5 2026-03-25 7/350 2026-03-29 00:32 by 我是小康
[考研] 071000生物学求调剂，初试成绩343 +7 小小甜面团 2026-03-25 7/350 2026-03-28 20:25 by 唐沐儿
[考研] 一志愿华北电力大学能动专硕，293，求调剂 +3 15537177284 2026-03-23 5/250 2026-03-28 16:11 by xxxsssccc
[考研] 一志愿中南大学化学0703总分337求调剂 +5 niko- 2026-03-27 5/250 2026-03-28 14:25 by 唐沐儿
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-03-27 6/300 2026-03-28 14:10 by 唐沐儿
[考研] 286求调剂 +12 PolarBear11 2026-03-26 12/600 2026-03-28 12:14 by zllcz
[考研] 265求调剂 +8 小木虫085600 2026-03-27 8/400 2026-03-27 22:16 by 无际的草原
[考研] 材料与化工085600，总分304，本科有两篇sci参与，求调剂 +10 幸运的酱酱 2026-03-22 12/600 2026-03-27 16:08 by muchong357
[考研] 一志愿吉大071010，316分求调剂 +3 xgbiknn 2026-03-27 3/150 2026-03-27 10:36 by guoweigw
[考研] 求调剂 +6 林之夕 2026-03-24 6/300 2026-03-27 08:38 by hypershenger
[考研] 317求调剂 +7 蛋黄咸肉粽 2026-03-26 7/350 2026-03-27 02:29 by fmesaito
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +3 崔wj 2026-03-26 3/150 2026-03-26 19:57 by nihaoar
[考研] 材料考研求调剂 +3 Dendel 2026-03-23 6/300 2026-03-26 17:51 by fmesaito
[考研] 302求调剂 +4 锦衣卫藤椒 2026-03-25 4/200 2026-03-25 16:29 by 功夫疯狂
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭