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追邃2015

新虫 (初入文坛)

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[求助] 请问我的菌落PCR测序产物目的片段是什么已有4人参与

请问我的菌落PCR测序产物是如下片段，用的M13引物，pMD-19 vector，因为我设计的引物是简并引物，所以序列里边找不到，想问谁知道我的目的片段怎么找，以及是什么？谢谢？
引物如下：F 5' CATSGANTGGGGTGTHAT 3'
R5' GTGRAGAATRCTCTTGWACT3'

以下是测序结果：CGATGGTAGCGCGGATCTTCAGAGATTACTGTTCTCCCGGCCTCAAATAACCCATCAATTATGATGCTGTATAAAATAGCTGAAGGCTTTATTCCCCTCTGCAGCATTTCTCTGAAAAGACTCAATCCTTCATCAATCCTTCCAATTTTACAATAGCCATTAACAAGTGTACAATACACTACAACGTTTGGTTCAATGCCAGCTGACACCATAGCATCAAATACTCTTAATGCTTTCTCCATCTTGCCAACAAGACAGTACCCATCCATCAGCATACTATACACCACAGCATCAGGATGCTGACCAGCATTTACAGTTAAGTCAAATATATTTTGTGCGTCCATTATCCTTCCCAGTTTGCAAAGGTTGTTAATTATCGAACTGAAGAAAACAATATCAAGACGCATGCCATTATTCATTATTTCCAAAATCAATTCCTTGGCTTTCAGTAAACTACCATGAGTACAAAAACCTTGAATCAGGCAATGGTATGCATATTTATCAGGTGCTACTCCTTGATCAATCATCTGATTAAATTTCTCCATAGCATCATCCATCTTACCGATTCTGCAGAGGGCAGCAATCACTGACGTATAGGTCACCACATCAGGTTTCACTCCATGGTCTCTCATTTCATTGAAGATGATCATAGCCTTATCTAGCATTCCACAGTTTGCATATGCCTTGATCAGCACACTAAAAGTATAAATGTCAGGTGCAATACCGTCACCTAGCATCAAATCGAAGAGATCTGTCATATCAACTAGACATCCTTTAGTGGCGTACCCGTTGAGCATAATTTTGTAGGAGAAAACATCAGGATTTTGGCCCTTCATTGCCATTGTGTCAAAAACATCTCTAGCTTCCTTGATTTTTCCATACTTGCAAAGGGAACCCATCAACATGTTAAAAGTAACAACATCTGGTAAGATGCTCTGTCTTCTCATTTCTTTAAATACCCTAACTGCCTCCTTCCACTGTCCTGTGGAGGAGTATCCATATATCAAGTTATTATATGTCCAGTTATTTGGCAGACACTTTATTGACATTTGTCGAAGAAAGCCTCTGCTGTCCATTGCTCTGCTTACCAGGCATGATCACAGAGCTATAGTCAACAAATCAGTGATACCCGGCTGTACATTTCTTTGAATAGATCCAATGCTTATTACGTTCACCTCCTTAGAGCGTCGATTACGTATGTAGCACCACGTTCGGGAACGAACGTTCCCCACG

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附件 1 : WU.seq

2014-06-12 13:43:17, 1.2 K

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1楼2014-06-12 12:55:16

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luwei13566

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
追邃2015: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-06-14 21:26:57

引用回帖:

18楼: Originally posted by 追邃2015 at 2014-06-13 15:51:50
模版是cDNA，目的片段620bp，这是我菌落PCR的图片，其中左边Marker1000,前6个样品引物为M13，后六个样品引物是M13和我设计的简并引物，再往后2个是我之前传上去的测序结果的菌落pcr(引物M13),一直找不到原因，为什 ...

1.LZ你现在最关键的问题是你的T载体到底连上了多大的序列。你的菌落PCR验证大小是600左右，但是送去测序的结果除去载体前后50bp也有将近1200的大小。到底是测序公司把别人的结果弄成你的了还是你的菌落PCR验证不可靠？你先和测序公司联系下，让他们仔细核对下你的样品编号，自己也可以把这次测序的转化子所含质粒提出来酶切检测大小并以质粒为模板PCR验证或者直接把质粒送测序。经过上面的验证如果连的是600那说明你的菌落PCR可靠，可以继续进行下面的实验。假如验证是1200bp那问题就多了。