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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » PCR扩增跑胶
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR扩增跑胶已有2人参与

各位大虾，求助啦！
我用提取的RNA进行反转录，然后用所得的cDNA进行PCR扩增。分别扩增了3个基因，c-myc，β-actin和hTERT，其中c-myc和β-actin都可以跑出条带，只有hTERT没有条带，做了三次，结果都是空白，胶上什么都没有，这是怎么回事，问题出在哪呢？
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1楼2014-06-09 18:07:05
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-10 20:08:48
hTERT
F1: gag tga ccg tgg ttt ctg tgt
R1: gag gag tag agg aag tgc ttg g
会不会是引物设计的不行呢？...

引物我看了下没有啥问题，你把退火温度做个梯度再看看能不能扩出来。要是还扩不出来那有可能HepG2不表达hTERT
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伊梦青lhq
8楼2014-06-11 08:49:00
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
伊梦青lhq: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 学习了！ 2014-06-11 10:39:41
你用的什么组织或细胞提的RNA？可能是引物出了问题？
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2楼2014-06-09 18:30:28
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-09 18:30:28
你用的什么组织或细胞提的RNA？可能是引物出了问题？

HepG2 人肝癌细胞，其他的两个基因都可以跑出条带来的。
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3楼2014-06-09 19:43:20
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-09 19:43:20
HepG2 人肝癌细胞，其他的两个基因都可以跑出条带来的。...

检查一下引物的序列
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4楼2014-06-09 20:37:12
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
要么不表达，要么PCR失败。
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5楼2014-06-10 18:31:32
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-06-10 18:31:32
要么不表达，要么PCR失败。

请问一下不表达是什么意思？
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6楼2014-06-10 20:06:35
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-09 20:37:12
检查一下引物的序列...

hTERT
F1: gag tga ccg tgg ttt ctg tgt
R1: gag gag tag agg aag tgc ttg g
会不会是引物设计的不行呢？
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7楼2014-06-10 20:08:48
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-10 20:06:35
请问一下不表达是什么意思？...

某些基因的mRNA太少，因细胞而异。
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9楼2014-06-11 09:18:13
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-11 08:49:00
引物我看了下没有啥问题，你把退火温度做个梯度再看看能不能扩出来。要是还扩不出来那有可能HepG2不表达hTERT...

非常感谢您的帮助。
我从hepG2细胞中提取RNA，经反转录得到cDNA，然后PCR，反应条件是：94度 1min；（94度 30sec,55度 30 sec,72度 5min)*30个循环;72度 10min
hTERT F1 Tm=60.0度
          R1 Tm=61.9度
麻烦你帮我看看这个条件合适吗？

谢谢！
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10楼2014-06-11 10:38:26
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