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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 目的基因的表达
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呀薯条

金虫 (小有名气)

[求助] 目的基因的表达 已有1人参与

我需要做目的基因的表达，现在已经克隆完成，回收质粒后，总是感觉质粒的浓度不够高，所以在双酶切后（由于没有通用缓冲液，所以是在分别酶切），感觉产物浓度更低，有时电泳条带都看不清。
   那我可以直接用克隆回收后的质粒作为PCR模板，经过扩增后，电泳回收产物，再将这个产物作为底物来进行双酶切操作以及后续与表达载体的连接吗？
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1楼 2014-05-22 16:14:37
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

for5

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 呀薯条 at 2014-05-24 09:55:08
既然这样可以，那为什么不可以直接在最初PCR后就进行酶切然后与表达载体的连接。。而是要通过与克隆载体连接后在进行后续表达实验呢？

实验新手，，谢谢指导啊...

本来就可以的啊。很多人就这么做。至于先克隆到t载体等扩增载体是由于连接相对容易，而直接连接表达载体要难一点。到扩增载体后可以快速测序，从而调整实验。这些个找周围实验室的问问不就很快就好了，就这么不好意思问。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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操蛋的XX
9楼2014-05-24 10:14:54
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而得名

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by for5 at 2014-05-24 10:14:54
本来就可以的啊。很多人就这么做。至于先克隆到t载体等扩增载体是由于连接相对容易，而直接连接表达载体要难一点。到扩增载体后可以快速测序，从而调整实验。这些个找周围实验室的问问不就很快就好了，就这么不好意 ...

浓度低可以做的啊，我经常这样做的啊，有时候跑胶都看不清楚，实验结果还挺好。
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10楼2014-05-24 11:23:27
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普通回帖

for5

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
呀薯条(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-22 19:25:00
呀薯条: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-05-23 11:54:18
那就质粒多提一点，胶回收好好做，回收率会高不少。浓度低点也可以做连接，只要基因和载体切干净就好，连接就是概率问题。

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操蛋的XX
2楼2014-05-22 16:22:13
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呀薯条

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by for5 at 2014-05-22 16:22:13
那就质粒多提一点，胶回收好好做，回收率会高不少。浓度低点也可以做连接，只要基因和载体切干净就好，连接就是概率问题。

那要是以回收的质粒为模板做个PCR，再电泳回收产物，然后再进行后续的酶切、连接等这样的做法可以吗？
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3楼2014-05-22 18:10:53
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for5

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 呀薯条 at 2014-05-22 18:10:53
那要是以回收的质粒为模板做个PCR，再电泳回收产物，然后再进行后续的酶切、连接等这样的做法可以吗？...

可以的啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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操蛋的XX
4楼2014-05-22 18:13:25
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meng_xu

铜虫 (小有名气)
可以，不过你到后来还要再测序，保证序列正确就可以
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5楼2014-05-23 06:06:06
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呀薯条

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by for5 at 2014-05-22 18:13:25
可以的啊
...

既然这样可以，那为什么不可以直接在最初PCR后就进行酶切然后与表达载体的连接。。而是要通过与克隆载体连接后在进行后续表达实验呢？

实验新手，，谢谢指导啊
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6楼2014-05-24 09:54:46
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呀薯条

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by for5 at 2014-05-22 18:13:25
可以的啊
...

既然这样可以，那为什么不可以直接在最初PCR后就进行酶切然后与表达载体的连接。。而是要通过与克隆载体连接后在进行后续表达实验呢？

实验新手，，谢谢指导啊
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7楼2014-05-24 09:54:55
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呀薯条

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by meng_xu at 2014-05-23 06:06:06
可以，不过你到后来还要再测序，保证序列正确就可以

既然这样可以，那为什么不可以直接在最初PCR后就进行酶切然后与表达载体的连接。。而是要通过与克隆载体连接后在进行后续表达实验呢？

实验新手，，谢谢指导啊
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8楼2014-05-24 09:55:08
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