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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 细胞RNA提取一直失败 ，什么原因？
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那1022

铜虫 (初入文坛)

[求助] 细胞RNA提取一直失败 ，什么原因？ 已有3人参与

新手，提取细胞RNA，连续几次都失败，不知问题出在哪里？
   具体步骤如下：
1） 6孔板，细胞汇合至90-100%，每孔加入1000ul trizol，反复吹打，使细胞溶解，室温静置5min。
2）将细胞的trizol裂解液转移至一1.5mlEP管中，加入200ul的氯仿/1000ul trizol，用手剧烈振摇15s，室温静置2－3min，4度  12000 转/分，离心15min。
3）吸取400ul上清转移至新的EP管中，加入500ul的异丙醇/1000ul trizol，上下摇晃3次，室温放置10min，4度 12000 转/分离心10min。
4）弃去上清（分别用大小枪头吸取），沉淀用1ml75％DEPC配制的乙醇溶液洗涤，4度 7500转/分 离心5min，
弃去乙醇溶液，加入20ul 0.1%的DEPC水溶解。
   
      按上述步骤， 连续几次提取时在加入异丙醇离心后都看不到沉淀，用75％乙醇洗涤后才见很小很小的白色沉淀，最终溶解后检测OD260/OD280基本都在1.6-1.7，电泳跑胶30分钟，只有加孔样孔发亮，或者加样孔下有很短的弥散。已经做了几次了，都是如此，不知道什么原因，请高手指点。
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1楼 2014-05-09 20:45:53
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飘落Oo天气

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-13 12:52:56
感觉你裂解细胞时没弄好，我提DNA用CTAB 60度裂解40分钟，其间多次用漩涡混匀器剧烈震荡。
提取RNA 直接加液氮在研本里面磨碎的。或者加 trizol 用破碎机破碎10分钟以上。
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4楼2014-05-12 23:15:38
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biot

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-13 12:52:50
是不是使用的东西没有灭菌，有RNAase？再就是乙醇没有吸干净，有残留

[ 发自小木虫客户端 ]
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扬帆起航！
3楼2014-05-10 08:10:33
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那1022

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-09 22:42:04
1. trizol试剂是哪个公司的，是否是真品，市场上有很多高仿trizol

2. “弃去乙醇溶液，加入20ul 0.1%的DEPC水溶解。”
这一步弃去乙醇溶液后，需要将沉淀晾干，然后加入DEPC处理水

3. 电泳时，用相对较高的电 ...

谢谢版主。  用的 trizol试剂是国产的，不过学姐之前用它提动物组织都没问题。我后来又做一次，将细胞裂解时间延长至15分钟，就提出来了。
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5楼2014-05-13 12:35:15
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那1022

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by biot at 2014-05-10 08:10:33
是不是使用的东西没有灭菌，有RNAase？再就是乙醇没有吸干净，有残留

谢谢回复。现在已经提出来了，是裂解时间不够。
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6楼2014-05-13 12:36:40
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