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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 毕赤酵母电击转化
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母电击转化 已有10人参与

转化了都不成功，只长出一个转化子，怎么办？
感受太制备方法是：
1.挑取单菌落至50mlYPD液体中，培养24小时左右，再转接至50mlYPD中，使初始OD为0.2-0.3.培养至OD为1.2-1.3
2.冰浴30分钟，离心，用50ml遇冷的无菌水洗，在用25ml无菌水洗。再后用1m山梨醇20ml悬浮。最后用0.35mll山梨醇悬浮分装。

电击：线性化质粒7ul与80ul感受太混匀，转入0.1cm遇冷电击杯中，电击条件1.5kv  电容25  电阻200


只长出一个转化子  要么就不长  不知道哦怎么继续啦，请同学们帮忙
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1楼 2014-05-04 20:29:45
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guojndx

金虫 (小有名气)

生物催化小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感受态制备有问题，你查一下文献，添加DTT会使效率提高。在用无菌水洗两次后，用1M山梨醇冰浴30min。线性化质粒尽量多一点，以前我做的时候一般20ul的。涂抗性平板之前，用山梨醇复苏1h，再加入YPD培养1h，之后再涂抗性或缺陷型平板。总之，祝成功吧！
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13楼2014-05-06 15:27:00
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玲林123

金虫 (初入文坛)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-05-05 10:04:19
我也出现这种情况，感受态制备好像很重要的，现在我也还没有成功
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2楼2014-05-05 08:18:20
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liyu0355

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-05-05 10:04:24
感受态最好现制现用；另外你加入的线性片段的量是多少？太少了也不行。
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3楼2014-05-05 08:54:56
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蓝索道人

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我记得protocol上写的是需要5-10ug的线性化质粒，当然少点也行，你的只有7ul不知道质粒浓度是多少？是不是量太少了。还有就是电压，可以降低一些
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努力就有收获！
4楼2014-05-05 15:10:54
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