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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 平端酶切连接
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

[求助] 平端酶切连接 已有3人参与

用Sma1、Xho1双酶切载体和 目的片段，然后连接，但是连了几次总是连不上，各位虫友有木有遇到相似的情况啊，求指教啊
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1楼 2014-04-28 10:42:00
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
20083630zhan(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-04-28 19:52:25
1、你加T4连接酶可以多加点（1微升），连接时间可以延长点（一般4度过夜）
2、如果上面方法不适用，那就用必杀技，就是：你先提高酶切质粒和酶切目的片段浓度，确认全切开后，T4连接酶连接过夜，然后跑胶，你会看见不同的几条带，有自连的，有没连接上的目的片段和载体片段，有你需要连接有目的片段的载体，然后根据你的bp量大小，胶回收所需条带，再转染感受态，涂板，培养。
  希望对你有帮助。
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2楼2014-04-28 11:05:12
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
20083630zhan(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-28 19:52:34
逐步排除吧，双酶切产物（不连接）转化感受态看下酶切情况如何，先确保酶切完全再去看连接
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只有不断地失败才会成功
3楼2014-04-28 15:18:44
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
外源一定要多，体系中就不要加水了，建议用NEB的连接酶

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2014-04-28 19:00:03
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15640142212

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-04-28 11:05:12
1、你加T4连接酶可以多加点（1微升），连接时间可以延长点（一般4度过夜）
2、如果上面方法不适用，那就用必杀技，就是：你先提高酶切质粒和酶切目的片段浓度，确认全切开后，T4连接酶连接过夜，然后跑胶，你会看见 ...

什么是平端连接呀？和粘端的区别是什么

发自小木虫Android客户端
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5楼2016-11-16 09:53:56
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