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leiqin

新虫 (小有名气)

[求助] 保真性太差,200多的片段有6-7个bp的错配 已有8人参与

请问我该如何提高克隆的保真性?

扩增的目的片段均小于500bp,有的甚至只有200bp多一点,我用的康为的taqmix,结果测序回来后发现226bp的片段错配了6-7个,不同的单克隆,分别错配6个和7个。

不知道如何能够提高保真性。

如果我用taqmix与高保真酶混合,什么样的比例比较合适?另外用什么缓冲液呢?taqmix本身就是酶在缓冲液中,不知道能不能直接将两者混合起来,比例是多少呢?

谢谢各位!
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
leiqin(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-28 19:55:30
扩增小于500 bp片段,常规Taq酶一般不会出现那么多的错配的。如果要求保真性比较高的话,建议采用pfu酶,pfu酶的PCR产物时平末端,如果你进行的TA克隆的话,需要加A,或者采用专门的平末端连接试剂盒。
rainwater
25楼2014-04-28 11:38:32
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leiqin(金币+1): 谢谢参与
1

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-04-27 14:12:54
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leiqin(金币+1): 谢谢参与
7楼2014-04-27 14:30:52
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leiqin(金币+1): 谢谢参与
8楼2014-04-27 14:32:44
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