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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » hepg2 细胞复苏
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丫头“笑笑”

银虫 (小有名气)

[求助] hepg2 细胞复苏 已有8人参与

我一个月前冻存的细胞，复苏两次了，都以失败告终啊。复苏时细胞量挺多的，但过夜后贴壁的细胞极少，换液后就剩一点儿了。如下图：



继续培养几天就这样了：



知道怎么回事嘛？我的冻存步骤是：收集细胞，加入1ml冻存液（10%DMSO）。4度10min，20度30min，-80度过夜，然后保存在液氮中。
复苏步骤是：从液氮中取出一管细胞后立即放入37度水浴中解冻，快速解冻后，再加入新鲜培养基过夜培养，换液。


能看出我的问题在哪嘛？
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我要我的自由！
1楼 2014-04-25 13:48:36
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丫头“笑笑”

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
22楼: Originally posted by yu756849034 at 2014-04-29 08:30:44
就是图片上这种。

QQ截图20140429082824.jpg
...

你用吖啶橙染细胞是为了检测什么啊？红色和绿色代表什么啊？
我是为了检测溶酶体膜稳定性的。按原理说吖啶橙在溶酶体中会呈红色或橘红色荧光，在细胞质和细胞核中是绿色荧光。可我染完只能观察到绿色荧光，不知道为什么。
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我要我的自由！
23楼2014-04-29 15:49:39
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kueradi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以试一试复苏的时候将冻存的细胞转入15ml离心管中，再向其中加入10ml培养基混匀，离心弃去上清，加入培养基重悬，最后加入培养皿中，过夜。
如果直接将冻存的细胞加入培养皿中的培养液，我们一般都是细胞贴壁（6h左右）后换液，因为DMSO长时间可能对一些细胞有损伤。
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2楼2014-04-25 14:52:20
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yu756849034

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不知道你的细胞悬液的量是多少？ 你的细胞在4℃放置的时间有点少，不过你的复苏应该是没有问题的。我们实验室的细胞冻存步骤是每一盘细胞用2ml10%的细胞冻存液制细胞悬液，然后分装到两个细胞冻存管中，20℃30min，4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，在转移至液氮之中。每次都能够复苏成功，试了好多次是没有问题的。
不过现在我们实验室买了梯度冻存盒，细胞冻存管密封完之后直接放到梯度冻存盒中放入-80℃过夜，在转移至液氮之中就行了。
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不作死不会死！！！
3楼2014-04-25 16:14:44
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丫头“笑笑”

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kueradi at 2014-04-25 14:52:20
可以试一试复苏的时候将冻存的细胞转入15ml离心管中，再向其中加入10ml培养基混匀，离心弃去上清，加入培养基重悬，最后加入培养皿中，过夜。
如果直接将冻存的细胞加入培养皿中的培养液，我们一般都是细胞贴壁（6 ...

我也有试过离心后再培养，一样不行的。
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我要我的自由！
4楼2014-04-25 16:57:22
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