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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 我的条带小于目的条带。。。求助。。。。
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hhl1230

新虫 (小有名气)

[求助] 我的条带小于目的条带。。。求助。。。。 已有5人参与

我的目的条带在500多一点，但是跑出来是小于500的，问过师兄师姐，好像不是引物二聚体。求各位前辈指教。PCR条件：
预变性：95℃，5min，
变性:95℃，30s，
退火：60.5℃，30s，
延伸：72℃，30s,
循环：34
再延伸：72℃，10min,
12℃forever
体积：10μl--------上游引物：0.4；
                            下游引物：0.4
                             模板：1
                              水：3.2
                              MIX：5
图中:12345为同样的引物，1,23,45分别为不同的模板

我的条带小于目的条带。。。求助。。。。
2.jpg
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1楼 2014-04-23 19:38:26
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-23 23:42:48
1、可适当提高退火温度增加特异性，2、胶跑的太烂，完全分不清楚，3、可以回收片段测序确认
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2楼2014-04-23 22:05:56
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xygcdmr

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-23 23:42:54
退火温度可以再高一点，延伸40秒，胶可以用2%的，跑的时间长一些，50分钟左右。
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3楼2014-04-23 22:53:52
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jonew

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
割胶测序不就行了
赞一下 回复此楼
借口很贱，，，
4楼2014-04-23 23:39:19
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提高退火温度，最好做一个梯度PCR，一般每1000bp延伸时间为1min,你的目的条带大于500的话，延伸时间也适当延长一下，比如2楼说的40s
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5楼2014-04-24 08:08:31
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hhl1230

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 世外清风 at 2014-04-23 22:05:56
1、可适当提高退火温度增加特异性，2、胶跑的太烂，完全分不清楚，3、可以回收片段测序确认

恩恩。。明天再换一下条件试一下。。。
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6楼2014-04-24 20:13:31
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hhl1230

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xygcdmr at 2014-04-23 22:53:52
退火温度可以再高一点，延伸40秒，胶可以用2%的，跑的时间长一些，50分钟左右。

嗯。但是50min会不会太长了，我跑的这个是用的1%的，120V，不到10min就跑成这样了。。
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7楼2014-04-24 20:15:07
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hhl1230

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jonew at 2014-04-23 23:39:19
割胶测序不就行了

我喊师姐看的时候她也这么说，但因为是新手，不敢这么霸气，所以要是再跑几次还这样，就直接切了。。。
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8楼2014-04-24 20:16:01
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hhl1230

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-04-24 08:08:31
提高退火温度，最好做一个梯度PCR，一般每1000bp延伸时间为1min,你的目的条带大于500的话，延伸时间也适当延长一下，比如2楼说的40s

嗯嗯。。
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9楼2014-04-24 20:16:27
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jonew

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hhl1230 at 2014-04-24 20:16:01
我喊师姐看的时候她也这么说，但因为是新手，不敢这么霸气，所以要是再跑几次还这样，就直接切了。。。...

大胆做
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借口很贱，，，
10楼2014-04-24 23:55:59
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