| 查看: 3416 | 回复: 15 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
感受态转化及阳性克隆出现问题已有6人参与
|
|||
|
大肠杆菌DH5a感受态转化 1、从-70℃冰箱中取感受态细胞悬液,冰上解冻5min。 2、 加入连接产物10μl (含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻弹匀,冰上放置30min。 3、42℃水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3min。 4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃,100r/min摇床培养1h,使细菌恢复正常生长状态 5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于LB平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 PCR验证阳性克隆 1.使用无菌白枪头将转化后长出的白色单菌落点种转移到含有氨苄青霉素的平板上，37℃过夜培养 2.挑取氨苄平板上的单菌落到含氨苄的LB液体培养基中，180rpm/min，37℃摇床培养3h 3.取2ml菌液作为PCR模板，PCR反应引物为T载体通用引物：RV-M和M13-17 4.PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，排除部分假阳性克隆片段 实验每次都是卡在PCR验证阳性克隆的第二步，37度摇床培养3h后培养基都很澄清，基本没有菌长出来，之前条白色单菌落到含氨苄的LB液体培养基中时，明显可以看到菌落接进去了呀，求大神帮帮忙看到底是哪里出了差错？？ |
回复此楼» 猜你喜欢
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有177人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
-
推荐一些基础有机化学的实验教程
已经有0人回复
-
探秘高分子世界：链动微观，筑就材料新篇
已经有0人回复
-
科研赋能时尚宠物：检测护航，焕新养宠体验
已经有0人回复
-
精测粗蛋白：以科研标尺，守品质核心
已经有0人回复
-
解码碳水世界：科研探秘，赋能营养与应用
已经有0人回复
-
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
kueradi
金虫 (小有名气)
- 应助: 20 (小学生)
- 金币: 1441.5
- 红花: 2
- 帖子: 126
- 在线: 249.6小时
- 虫号: 2263328
- 注册: 2013-01-27
- 专业: 细胞死亡
15楼2014-04-21 12:23:22
2楼2014-04-18 17:50:23
Neo2000
木虫 (著名写手)
- 应助: 639 (博士)
- 金币: 8720.2
- 红花: 37
- 帖子: 1700
- 在线: 269.3小时
- 虫号: 322365
- 注册: 2007-03-11
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
3楼2014-04-18 17:55:58
kueradi
金虫 (小有名气)
- 应助: 20 (小学生)
- 金币: 1441.5
- 红花: 2
- 帖子: 126
- 在线: 249.6小时
- 虫号: 2263328
- 注册: 2013-01-27
- 专业: 细胞死亡
4楼2014-04-18 20:09:06