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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切 连接转化问题
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疋蓼丌520

金虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切 连接转化问题 已有1人参与

本人利用 双酶切链接一段1Kbp大小的基因到pet-28A载体上
然后热转到大肠杆菌中  酶切位点选的是Hind III 和Not I
酶切之后的载体和基因都经过切胶回收处理
并且切胶回收之后的样品进行电泳也均有条带

已经多次连接转化 都未成功

PS: 之前这段基因连接成功过 只是酶切位点选择有误 改换酶切位点后就一直连不上了 不知道是不是酶切位点对这次的连接的影响
请大家指导 O(∩_∩)O谢谢
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1楼 2014-04-15 20:39:03
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疋蓼丌520

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 无启 at 2014-04-16 09:14:18
大肠杆菌时间长什么的也考虑考虑。切胶回收后的条带你看看大小是否正确。
酶切位点的话可能会有影响。在排除酶失效和酶切位点没选错的情况下，
1.两个酶是同时切的还是分开切的？同时切的话要看buffer是否可以。
...

切胶回收后的条带大小都是正确的 酶应该没有问题
小伙伴也用的这两个酶切位点最近做的也连上了
酶是TAKALA他们家的 两个酶是同时切 buffer 是严格按照TAKALA说明书上的配比 每次都能切开 或许不是酶切的问题吧
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4楼2014-04-16 09:49:46
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疋蓼丌520

金虫 (初入文坛)
2楼2014-04-15 20:41:09
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无启

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
疋蓼丌520(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-04-16 19:36:11
大肠杆菌时间长什么的也考虑考虑。切胶回收后的条带你看看大小是否正确。
酶切位点的话可能会有影响。在排除酶失效和酶切位点没选错的情况下，
1.两个酶是同时切的还是分开切的？同时切的话要看buffer是否可以。
2.Not1是难切，该位点序列是8个碱基，你用的是哪个公司的？TAKALA的说明书上是1h，我联系过宝生物的技术支持，可以尝试3h,有的人会酶切过夜。
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志存高远，脚踏实地。
3楼2014-04-16 09:14:18
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