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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 急，求各位帮忙分析原因，关于pcr与跑胶的问题
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意萧02

木虫 (正式写手)

[求助] 急，求各位帮忙分析原因，关于pcr与跑胶的问题 已有2人参与

各位虫友大家好，本人刚接触做水稻QTL的课题，在pcr与连续聚丙烯凝胶电泳时出现问题了，请给位帮忙分析原因，在此先谢谢了。

我做的目标DNA片段大约50bP左右。pcr体系分别为：
ddH2O                    3.2ul
混合酶（买的）       5ul（每分钟扩增1-2kB，预混loading buffer装)
引物                         1ul
模板DNA                  0.8ul

PCR参数：
94度         5min
94度         45s
55度         45s
72度         90s
72度         7min
4度           无穷

聚丙烯酰胺凝胶电泳配置(每板）：
H20                                 30ml
母液（40%丙烯酰胺）    6ml
50xTAE缓冲液                 300ul
10% APS                         300ul
TEMED                            25ul
上样量1.6ul  电压120v  90min
结果有的可以跑出条带，有的模糊不清，几乎没有，还有拖带现象，具体如下图所示，三图来自不同的三种引物。
DNA样，混合酶等问题可以排除，请问还可能问题出在哪？是引物的问题吗？

急，求各位帮忙分析原因，关于pcr与跑胶的问题
不能跑出.jpg


急，求各位帮忙分析原因，关于pcr与跑胶的问题-1
不能跑出条带.jpg


急，求各位帮忙分析原因，关于pcr与跑胶的问题-2
可以跑出条带.jpg
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1楼 2014-04-02 18:39:42
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-02 21:16:09
你点marker了吗，没有的话也不好说是胶的问题还是PCR的问题，如果marker是清晰的，那胶没有问题。
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2楼2014-04-02 20:07:12
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

意萧02

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2014-04-02 20:07:12
你点marker了吗，没有的话也不好说是胶的问题还是PCR的问题，如果marker是清晰的，那胶没有问题。

点了，marker没问题哦
赞一下 回复此楼
3楼2014-04-02 20:13:37
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 意萧02 at 2014-04-02 20:13:37
点了，marker没问题哦...

那可能是引物不特异，你提高退火温度试试，或者做个梯度。再不行就得优化引物
赞一下 回复此楼
4楼2014-04-02 20:19:48
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D调的小E

铁杆木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
意萧02: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-04-03 16:03:05
意萧02(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-04-03 19:22:23
感觉应该是引物特异性不强，同意楼上的，做个梯度PCR验证一下吧
赞一下 回复此楼
You just need a little faith!
5楼2014-04-03 10:30:53
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

867575969

至尊木虫 (著名写手)

One Piece

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
lz能给张大图不，看的我眼都花了，还有Mark在吗。可以标出来不？
赞一下 回复此楼
有些东西因为得不到而变得美好，有些东西因为拥有而变得弥足珍贵！
6楼2014-04-04 14:01:16
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