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意萧02

木虫 (正式写手)

[求助] 急,求各位帮忙分析原因,关于pcr与跑胶的问题 已有2人参与

各位虫友大家好,本人刚接触做水稻QTL的课题,在pcr与连续聚丙烯凝胶电泳时出现问题了,请给位帮忙分析原因,在此先谢谢了。

我做的目标DNA片段大约50bP左右。pcr体系分别为:
ddH2O                    3.2ul
混合酶(买的)       5ul(每分钟扩增1-2kB,预混loading buffer装)
引物                         1ul
模板DNA                  0.8ul

PCR参数:
94度         5min
94度         45s
55度         45s
72度         90s
72度         7min
4度           无穷

聚丙烯酰胺凝胶电泳配置(每板):
H20                                 30ml
母液(40%丙烯酰胺)    6ml
50xTAE缓冲液                 300ul
10% APS                         300ul
TEMED                            25ul
上样量1.6ul  电压120v  90min
结果有的可以跑出条带,有的模糊不清,几乎没有,还有拖带现象,具体如下图所示,三图来自不同的三种引物。
DNA样,混合酶等问题可以排除,请问还可能问题出在哪?是引物的问题吗?

急,求各位帮忙分析原因,关于pcr与跑胶的问题
不能跑出.jpg


急,求各位帮忙分析原因,关于pcr与跑胶的问题-1
不能跑出条带.jpg


急,求各位帮忙分析原因,关于pcr与跑胶的问题-2
可以跑出条带.jpg
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-04-02 21:16:09
你点marker了吗,没有的话也不好说是胶的问题还是PCR的问题,如果marker是清晰的,那胶没有问题。
2楼2014-04-02 20:07:12
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意萧02

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2014-04-02 20:07:12
你点marker了吗,没有的话也不好说是胶的问题还是PCR的问题,如果marker是清晰的,那胶没有问题。

点了,marker没问题哦
3楼2014-04-02 20:13:37
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 意萧02 at 2014-04-02 20:13:37
点了,marker没问题哦...

那可能是引物不特异,你提高退火温度试试,或者做个梯度。再不行就得优化引物
4楼2014-04-02 20:19:48
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D调的小E

铁杆木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
意萧02: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-04-03 16:03:05
意萧02(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-04-03 19:22:23
感觉应该是引物特异性不强,同意楼上的,做个梯度PCR验证一下吧
You just need a little faith!
5楼2014-04-03 10:30:53
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867575969

至尊木虫 (著名写手)

One Piece

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
lz能给张大图不,看的我眼都花了,还有Mark在吗。可以标出来不?
有些东西因为得不到而变得美好,有些东西因为拥有而变得弥足珍贵!
6楼2014-04-04 14:01:16
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