应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » His标签蛋白纯化过程中容易沉淀，提高盐离子、改变pH是否可以？
51/1返回列表
查看: 3145  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

flowerkiddy

新虫 (小有名气)

[求助] His标签蛋白纯化过程中容易沉淀，提高盐离子、改变pH是否可以？ 已有2人参与

请教各位虫友！
融合蛋白是一个醇脱氢酶，理论pI=6.3，C端氮端分别带His6。
纯化条件：镍珠纯化，没上柱子，PBS pH7.4（pH可能有0.3个单位的误差、试了几个pH计都没法完全校准），0.5M NaCl。
现象：胶上看诱导表达的可溶性蛋白量还是不错的。
         结合的很好，珠子明显变为白色。
         50mM咪唑开始洗脱时就明显有白色沉淀析出。
         大部分蛋白500mM咪唑洗脱下来，纯化完可以得到一些活性蛋白的，但是浓度不高。
         得到的纯化蛋白透析时，盐浓度不变，只降咪唑浓度，又有沉淀析出。

问题：蛋白稳定性问题能否通过提高NaCl浓度至1M甚至更高？PBSpH升高到8或8.5甚至更好是否合适？
谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-03-17 11:26:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flowerkiddy

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2014-03-17 14:14:37
500mM 咪唑，可以计算一下咪唑的pKa，这个浓度的咪唑已经足够改变你的buffer pH值了，所以咪唑被稀释后，溶液pH值改变，有可能导致蛋白析出，试试离心后然后用不同的溶液，看能否重溶，溶解后看是否有活性？

提高 ...

谢谢！
咪唑梯度我是用PBS溶解以后调整到pH7.4的。
赞一下 回复此楼
4楼2014-03-19 15:51:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
500mM 咪唑，可以计算一下咪唑的pKa，这个浓度的咪唑已经足够改变你的buffer pH值了，所以咪唑被稀释后，溶液pH值改变，有可能导致蛋白析出，试试离心后然后用不同的溶液，看能否重溶，溶解后看是否有活性？

提高盐浓度，有可能有两种效果, salt in OR salt out, 需要尝试吧，供参考！

Good Luck!
赞一下(1人) 回复此楼
行至水穷处，坐看云起时
2楼2014-03-17 14:14:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
放在4度纯化下试试。沉淀析出说明蛋白变性了。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2014-03-18 02:06:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

会思想的芦苇

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2014-03-17 14:14:37
500mM 咪唑，可以计算一下咪唑的pKa，这个浓度的咪唑已经足够改变你的buffer pH值了，所以咪唑被稀释后，溶液pH值改变，有可能导致蛋白析出，试试离心后然后用不同的溶液，看能否重溶，溶解后看是否有活性？

提高 ...

不敢苟同，试问透析液pH7.4 蛋白液也是7.4 即使咪唑稀释了，又怎么发生ph改变呢
赞一下 回复此楼
5楼2014-03-19 17:19:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[文学芳草园] 梦想 +5 myrtle 2026-08-26 7/350 2026-09-01 15:18 by myrtle
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +13 Kittylucky 2026-08-27 14/700 2026-09-01 11:06 by feng6531
[论文投稿] 小白求助 投论文要求的highlights应该如何写 5+3 l1963982152 2026-08-29 4/200 2026-09-01 09:04 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +6 叶九微 2026-08-26 6/300 2026-08-31 23:54 by yudaoqian88
[基金申请] 国社科又开始会评了，不知道这次命运如何 +7 雨打竹帘 2026-08-30 11/550 2026-08-31 23:16 by hittle2008
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +6 zhaosm1982 2026-08-27 7/350 2026-08-31 21:18 by qdxxmc
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +6 yuleib84 2026-08-26 7/350 2026-08-31 19:46 by 鱼翔浅底1
[基金申请] 能否申诉？ +7 echo8914667 2026-08-30 8/400 2026-08-31 17:00 by yihongxu
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭