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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » His标签蛋白纯化过程中容易沉淀，提高盐离子、改变pH是否可以？
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flowerkiddy

新虫 (小有名气)

[求助] His标签蛋白纯化过程中容易沉淀，提高盐离子、改变pH是否可以？ 已有2人参与

请教各位虫友！
融合蛋白是一个醇脱氢酶，理论pI=6.3，C端氮端分别带His6。
纯化条件：镍珠纯化，没上柱子，PBS pH7.4（pH可能有0.3个单位的误差、试了几个pH计都没法完全校准），0.5M NaCl。
现象：胶上看诱导表达的可溶性蛋白量还是不错的。
         结合的很好，珠子明显变为白色。
         50mM咪唑开始洗脱时就明显有白色沉淀析出。
         大部分蛋白500mM咪唑洗脱下来，纯化完可以得到一些活性蛋白的，但是浓度不高。
         得到的纯化蛋白透析时，盐浓度不变，只降咪唑浓度，又有沉淀析出。

问题：蛋白稳定性问题能否通过提高NaCl浓度至1M甚至更高？PBSpH升高到8或8.5甚至更好是否合适？
谢谢！
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1楼 2014-03-17 11:26:37
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
500mM 咪唑，可以计算一下咪唑的pKa，这个浓度的咪唑已经足够改变你的buffer pH值了，所以咪唑被稀释后，溶液pH值改变，有可能导致蛋白析出，试试离心后然后用不同的溶液，看能否重溶，溶解后看是否有活性？

提高盐浓度，有可能有两种效果, salt in OR salt out, 需要尝试吧，供参考！

Good Luck!
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2014-03-17 14:14:37
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
放在4度纯化下试试。沉淀析出说明蛋白变性了。
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3楼2014-03-18 02:06:22
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flowerkiddy

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2014-03-17 14:14:37
500mM 咪唑，可以计算一下咪唑的pKa，这个浓度的咪唑已经足够改变你的buffer pH值了，所以咪唑被稀释后，溶液pH值改变，有可能导致蛋白析出，试试离心后然后用不同的溶液，看能否重溶，溶解后看是否有活性？

提高 ...

谢谢！
咪唑梯度我是用PBS溶解以后调整到pH7.4的。
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4楼2014-03-19 15:51:22
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会思想的芦苇

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2014-03-17 14:14:37
500mM 咪唑，可以计算一下咪唑的pKa，这个浓度的咪唑已经足够改变你的buffer pH值了，所以咪唑被稀释后，溶液pH值改变，有可能导致蛋白析出，试试离心后然后用不同的溶液，看能否重溶，溶解后看是否有活性？

提高 ...

不敢苟同，试问透析液pH7.4 蛋白液也是7.4 即使咪唑稀释了，又怎么发生ph改变呢
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5楼2014-03-19 17:19:31
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

楼上说的有道理，我补充一下纯化his-tag蛋白，最好不用PBS，尤其是浓度太高的PBS缓冲液，因为磷酸根和Ni（II）容易形成沉淀
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行至水穷处，坐看云起时
6楼2014-03-19 20:29:49
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nono000

禁虫
本帖内容被屏蔽
7楼2020-06-22 22:25:19
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pennchem

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by nono000 at 2020-06-22 22:25:19
请问有什么试剂可以融蛋白，并让他有活性。...

如果是Alcohol dehydrogenase之类的蛋白，活性中心含有金属，能避免用金属柱最好（可能结合到活性中心），MBP，SUMO等都是增溶的tag，而且可以切除，没有金属离子结合。
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行至水穷处，坐看云起时
8楼2020-06-23 07:53:43
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