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anmengdy

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR结果不好,胶回收后浓度很低 已有2人参与

最近在做分子实验,好多东西不清楚,我们实验室之前做化学的,所以也没师兄师姐,老师可以问。
跑了PCR,好像引物二聚体比较严重,拖带,条带不够亮,胶回收之后浓度别低,想问问大家出了什么问题,怎么解决!

PCR结果不好,胶回收后浓度很低
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PCR结果不好,胶回收后浓度很低-1
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apety

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
anmengdy: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-03-13 15:13:22
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-13 19:00:01
我的问题:1、你的对照组是哪个?2、胶回收的时候要用大孔点样,如果你是用的第一个图切胶回收,那果断浓度低。3、试剂盒的操作步骤有误,切胶后溶胶时要轻微震荡,不要试剂盒上说多少分钟就多少分钟,一般55℃的时候,5min左右就可以,关键看胶有没有完全融化4、点样时速度要快,要不然样品会弥散的(一般不会。。。除非你点很久)5、提醒你注意一下。。。你跑胶的时间有点长,或者说胶浓度太低,条带最好在胶中间,你的条带都快跑到最下面去了
2楼2014-03-13 12:28:24
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
胶回收之后浓度别低,可以多扩几管回收。
3楼2014-03-13 14:31:49
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普通回帖

anmengdy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by apety at 2014-03-13 12:28:24
我的问题:1、你的对照组是哪个?2、胶回收的时候要用大孔点样,如果你是用的第一个图切胶回收,那果断浓度低。3、试剂盒的操作步骤有误,切胶后溶胶时要轻微震荡,不要试剂盒上说多少分钟就多少分钟,一般55℃的时 ...

我没有做对照,回收的时候是大孔,第二图很亮的是引物二聚体,目的条带很浅,不知道怎么改进,因为目的基因比较小,一百多bp,用的是1.5%的胶,所以有点跑出去了,跑太短时间mark跑不开。回收可能融化时间过长了(10min,60℃)
4楼2014-03-13 15:01:15
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anmengdy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-13 14:31:49
胶回收之后浓度别低,可以多扩几管回收。

明白了,多谢!
5楼2014-03-13 15:05:35
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anmengdy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by apety at 2014-03-13 12:28:24
我的问题:1、你的对照组是哪个?2、胶回收的时候要用大孔点样,如果你是用的第一个图切胶回收,那果断浓度低。3、试剂盒的操作步骤有误,切胶后溶胶时要轻微震荡,不要试剂盒上说多少分钟就多少分钟,一般55℃的时 ...

我没有做对照,回收的时候用的是大孔,胶融化可能融化有点长(10min,60℃),用的是1.5%的胶,目的基因有点小,所以跑的比较下面,时间太短了好像mark跑不开。第二个图亮的那个是引物二聚体,目的条带很浅的,不知道要怎么改进!
多谢了!
6楼2014-03-13 15:10:06
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-13 19:00:51
引用回帖:
6楼: Originally posted by anmengdy at 2014-03-13 15:10:06
我没有做对照,回收的时候用的是大孔,胶融化可能融化有点长(10min,60℃),用的是1.5%的胶,目的基因有点小,所以跑的比较下面,时间太短了好像mark跑不开。第二个图亮的那个是引物二聚体,目的条带很浅的,不知道 ...

1%的胶,90V,30min取出看看,不行接着跑。目的基因有150,不宜长时间电泳。
7楼2014-03-13 15:39:24
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anmengdy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-13 15:39:24
1%的胶,90V,30min取出看看,不行接着跑。目的基因有150,不宜长时间电泳。...

好的,等下试下!
8楼2014-03-13 16:14:49
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anmengdy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-13 14:31:49
胶回收之后浓度别低,可以多扩几管回收。

胶回收前非常的亮,而且已经多扩了两管了,但是回收之后浓度还是很低,怎么回事呢?
9楼2014-03-17 16:54:01
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呀薯条

金虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by anmengdy at 2014-03-17 16:54:01
胶回收前非常的亮,而且已经多扩了两管了,但是回收之后浓度还是很低,怎么回事呢?...

你的浓度时多少?我回收后是十几纳克每微升,我这个值是不是也是比较低了?第一次做分子这些实验,不太懂
10楼2014-04-10 10:48:10
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