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feiyun2006

铁虫 (小有名气)

[求助] 求芽孢杆菌穿梭质粒以及基因敲除经验 已有1人参与

(1) 利用同源重组希望敲掉几个基因,电转化线状质粒。经抗生素筛选后有挑到几个克隆,但PCR检测结果均与预期不符合,
是否抗性基因会插入其他非预期的位置?或者还有其他原因?不知道芽孢杆菌基因敲除有啥要注意的地方,可以多交流下经验
    (2) 我们的实验没有阳性对照,所以我们希望首先能利用穿梭质粒来验证转化方法是否正确。谁有能在芽孢杆菌中复制的质粒啊,能否赠送?
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心静自然凉
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

引用回帖:
14楼: Originally posted by feiyun2006 at 2014-03-19 14:21:14
我比较赞同你的观点,线状片段只有发生了双交换的才能进行抗性筛选。你们实验室是怎么做芽孢杆菌基因敲除的啊?
  接合转移我没做过。
  ...

我们正打算做,前面做的假单胞菌的。因为直接把目的基因敲除,而不是用标记片段替换;所以采用接合转移,用自杀载体上的标记基因筛选第一次重组;之后SacB筛选二次重组的。
我想了一下,我们前面做的不适合采用线性质粒(因为直接双交换,又没有筛选标记)。

马上要做芽孢杆菌的了,求交流学习。。^_^
做一个阳光、开朗的小和尚
15楼2014-03-19 18:41:13
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句号123

新虫 (初入文坛)


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-03-11 14:32:16
本帖内容被屏蔽

2楼2014-03-11 12:38:23
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feiyun2006

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 句号123 at 2014-03-11 12:38:23
PHT43 PHT01 可以吗

应该可以吧,你们是用什么方法转化的啊?
心静自然凉
3楼2014-03-11 14:21:16
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句号123

新虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

4楼2014-03-11 15:58:07
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