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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 求芽孢杆菌穿梭质粒以及基因敲除经验
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feiyun2006

铁虫 (小有名气)

[求助] 求芽孢杆菌穿梭质粒以及基因敲除经验 已有1人参与

(1) 利用同源重组希望敲掉几个基因，电转化线状质粒。经抗生素筛选后有挑到几个克隆，但PCR检测结果均与预期不符合，
是否抗性基因会插入其他非预期的位置？或者还有其他原因？不知道芽孢杆菌基因敲除有啥要注意的地方，可以多交流下经验
    (2) 我们的实验没有阳性对照，所以我们希望首先能利用穿梭质粒来验证转化方法是否正确。谁有能在芽孢杆菌中复制的质粒啊，能否赠送？
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心静自然凉
1楼 2014-03-11 10:51:07
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by feiyun2006 at 2014-03-18 22:44:08
(1) 从我看的文献来看，环状质粒由于结构的原因多用于单交换；而双交换进行的同源重组则一般采用线状片段。Mol Biol Rep (2010) 37:2207–2213
(2) 效率是不是更高还真不知道，希望多指点指点...

如果目的片段具左右同源臂，以环状质粒转进目标菌后，是不是先发生单交换，质粒整合到基因组上；然后再发生二次重组，质粒片段丢弃？如果线性质粒的话，是直接进行相当于前述的二次重组？不太懂，求指教。

另：接合转移的话，转入的是线性质粒吗？
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做一个阳光、开朗的小和尚
13楼2014-03-19 09:15:47
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by feiyun2006 at 2014-03-19 14:21:14
我比较赞同你的观点，线状片段只有发生了双交换的才能进行抗性筛选。你们实验室是怎么做芽孢杆菌基因敲除的啊？
  接合转移我没做过。
  ...

我们正打算做，前面做的假单胞菌的。因为直接把目的基因敲除，而不是用标记片段替换；所以采用接合转移，用自杀载体上的标记基因筛选第一次重组；之后SacB筛选二次重组的。
我想了一下，我们前面做的不适合采用线性质粒（因为直接双交换，又没有筛选标记）。

马上要做芽孢杆菌的了，求交流学习。。^_^
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做一个阳光、开朗的小和尚
15楼2014-03-19 18:41:13
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普通回帖

句号123

新虫 (初入文坛)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-03-11 14:32:16
本帖内容被屏蔽
2楼2014-03-11 12:38:23
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feiyun2006

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 句号123 at 2014-03-11 12:38:23
PHT43 PHT01 可以吗

应该可以吧，你们是用什么方法转化的啊？
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心静自然凉
3楼2014-03-11 14:21:16
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句号123

新虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
4楼2014-03-11 15:58:07
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
请教一下，为什么要将重组质粒线性化后再转进芽孢杆菌呢？是在哪个位置线性化呢？
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做一个阳光、开朗的小和尚
5楼2014-03-11 17:34:49
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句号123

新虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
6楼2014-03-11 20:57:10
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feiyun2006

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-03-11 17:34:49
请教一下，为什么要将重组质粒线性化后再转进芽孢杆菌呢？是在哪个位置线性化呢？

据说这样比环状质粒重组效率高
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心静自然凉
7楼2014-03-12 14:36:17
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feiyun2006

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 句号123 at 2014-03-11 20:57:10
电专

你们具体是怎么做的啊？求助啊
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心静自然凉
8楼2014-03-12 14:38:00
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by feiyun2006 at 2014-03-12 14:36:17
据说这样比环状质粒重组效率高...

求关于线性质粒重组效率更高的参文，诚谢啊
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做一个阳光、开朗的小和尚
9楼2014-03-12 20:54:56
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tangbao66

银虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无有效解答 2014-03-19 15:58:42
楼主用什么方法转化的！模式菌还是野生菌啊！

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10楼2014-03-13 00:22:59
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