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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pet32a双酶切之后，电泳条带找不到
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

[求助] pet32a双酶切之后，电泳条带找不到 已有3人参与

小弟本科生一枚，最近在构建一种菌，可是经过了两个月的尝试，还是没有成功，愁死了，这个是学校的一个大学生训练项目，搞了这么久还没构建出菌种，我在九月之前还要做出目的蛋白的表达，对表达蛋白的性质做出研究，才能结题，现在是愁死了，求告各位大侠给予意见。
首先，我用的是X-hol和BamHI这两个酶，目的基因在2700左右，目的基因在经过PCR之后，做37度双酶切6h能跑出目的条带。这个是确定的。但是在双酶切32a质粒之后，确实无论如何也跑不出条带。后来又做了单酶切切pet-32a质粒，但是3h之后，依旧是没有任何条带出现。（声明：32a未经酶切的质粒是跑得出来的。）今日又做了分小时单酶切，做法是每半小时去一次37度酶切样品，迅速放入65度烘箱中使其中的酶失活，共切了两个小时，却还是没有跑出任何条带，这不应该啊，刚加入酶就取样的也没跑出来，这太不合理了吧！（取样：2微升跑胶。）今天的除了没有酶切过的质粒跑出来了非常明显的条带，其余的都没跑出来，是跑胶打样太少了么？
双酶切体系：50微升
10Xbuffer tango   10微升
BamHi                   2微升
X-hol                     2微升
pet-32a质粒                      36微升（有时质粒浓度高的话也会用25微升质粒加11微升ddH2O）
37度水浴6h
单酶切体系：20微升
buffer tango      4微升
BamHI              0.5微升
32a质粒          10微升
ddH2O            5.5微升

单酶切体系：20微升
buffer tango    4微升
X-hol               0.5微升
32a质粒          10微升
ddH2O            5.5微升

另外，跑胶电压是100V 时间是40分钟 这个应该不会有什么问题吧？
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1楼 2014-03-06 22:13:19
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-03-07 09:41:35
换个新酶试试吧，单酶切双酶切都没有出带，再一个你的质粒确定是32a并且有这几个酶切位点。
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hehe
4楼2014-03-07 08:14:46
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查看全部 11 个回答

youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
无敌小莫(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-03-07 09:41:30
个人觉得你的酶可能出问题了

你可以做以下尝试

将酶切的质粒和不酶切的质粒同条件处理（6小时，温度）

然后去检测

2 按时间酶切，分别酶切15分钟，30分钟，1小时，2小时，电泳
赞一下 回复此楼
天行健
2楼2014-03-06 22:46:22
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-03-06 22:46:22
个人觉得你的酶可能出问题了

你可以做以下尝试

将酶切的质粒和不酶切的质粒同条件处理（6小时，温度）

然后去检测

2 按时间酶切，分别酶切15分钟，30分钟，1小时，2小时，电泳

我之前也做过对照了，只是没有同等条件处理，是将提出来的质粒，和酶切后的同时跑胶，结果是酶切后的没跑出来。还有，如果酶出了问题，那目的基因又是怎么会切出来呢？你说的第二个 我明天再做下。
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3楼2014-03-06 22:53:01
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-07 08:14:46
换个新酶试试吧，单酶切双酶切都没有出带，再一个你的质粒确定是32a并且有这几个酶切位点。

位点是有的，我今天又有新发现，发现单独的只有质粒放在37度水浴之后再跑胶直接就没了，两微升的质粒。
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5楼2014-03-07 21:11:27
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