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wh6125

铁虫 (初入文坛)

[求助] 做了原核表达,表达量很低,求助~~已有8人参与

用pET-28a构建的原核表达载体,带N端His标签,测序、酶切都正确,菌株用的是BL21(DE3),16℃ 8h、20h及30℃ 3h都有表达,但是表达量很低(见附件中红框标注),求助是应该优化表达条件还是换载体试试呢?这种表达量不能纯化吧?
图中依次为Marker,空载体(诱导前、后),目的蛋白(1、2诱导前),目的蛋白(1,2诱导后)
后面三条浅的是诱导后的空载体及目的蛋白沉淀
做了原核表达,表达量很低,求助~~
IMG_0730.jpg
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dingchaoyue

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我建议先优化条件,换载体的话,也许表达量可能也不高(之前我也遇到过这种情况,是PET28a的载体,换了GST后没有觉得表达明显增加)。
你可以做个不同IPTG的浓度来验证表达量,温度的话不要太高,因为如果你用这个蛋白做活性分析的话,那么温度高也许会有影响;
其实,我觉得你这个载体可以用来纯化了,你想要多的话,可以多摇菌来诱导表达。你摇菌摇得多,然后纯化过柱时多过柱几遍,应该会达到你要纯化的量。
12楼2014-03-09 12:39:31
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

楼主可以试试延长诱导时间,加大诱导剂量
植根于内心的修养;无需提醒的自觉;以约束为前提的自由;为别人着想的善良
2楼2014-03-06 15:07:55
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wh6125

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-03-06 15:07:55
楼主可以试试延长诱导时间,加大诱导剂量

我用的是1mM的IPTG,还可以再加大用量么?
3楼2014-03-06 15:40:21
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wh6125 at 2014-03-06 15:40:21
我用的是1mM的IPTG,还可以再加大用量么?...

可以试试看,你可以做三个,一个延长时间,一个加大剂量,一个两者都有
植根于内心的修养;无需提醒的自觉;以约束为前提的自由;为别人着想的善良
4楼2014-03-06 15:56:39
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