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wh6125

铁虫 (初入文坛)

应助: 2 (幼儿园)
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虫号: 2233603
注册: 2013-01-10
专业: 园林学

[求助] 做了原核表达，表达量很低，求助~~已有8人参与

用pET-28a构建的原核表达载体，带N端His标签，测序、酶切都正确，菌株用的是BL21(DE3)，16℃ 8h、20h及30℃ 3h都有表达，但是表达量很低（见附件中红框标注），求助是应该优化表达条件还是换载体试试呢？这种表达量不能纯化吧？
图中依次为Marker，空载体（诱导前、后），目的蛋白（1、2诱导前），目的蛋白（1，2诱导后）
后面三条浅的是诱导后的空载体及目的蛋白沉淀

IMG_0730.jpg

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1楼2014-03-06 14:10:38

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dingchaoyue

木虫 (著名写手)

应助: 32 (小学生)
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虫号: 1918337
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专业: 植物遗传学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

我建议先优化条件，换载体的话，也许表达量可能也不高（之前我也遇到过这种情况，是PET28a的载体，换了GST后没有觉得表达明显增加）。
你可以做个不同IPTG的浓度来验证表达量，温度的话不要太高，因为如果你用这个蛋白做活性分析的话，那么温度高也许会有影响；
其实，我觉得你这个载体可以用来纯化了，你想要多的话，可以多摇菌来诱导表达。你摇菌摇得多，然后纯化过柱时多过柱几遍，应该会达到你要纯化的量。