24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

额敏的雪

金虫 (著名写手)

应助: 9 (幼儿园)
金币: 957
散金: 132
红花: 15
沙发: 7
帖子: 1274
在线: 57.2小时
虫号: 1833575
注册: 2012-05-25
性别: MM
专业: 植物生理与生化

[求助] PCR后跑胶没有任何条带已有17人参与

自己设计了10对引物，跑胶没有任何条带，10对引物都没有出条带，可能原因是什么？是不是说明引物设计的不好？
因为，1.同样的cDNA，用别人的引物（同一植物的其他基因引物）就有条带。2.做了温度梯度PCR，每个温度梯度都没有条带，3 用引物直接跑胶，引物有条带，说明引物存在（我担心稀释的时候引物不小心散出来），4 ，请问还能做些什么来找出问题产生的原因
可是设计引物的时候什么二聚体，错配，跨内含子的网上书上找到的哪些能注意的我都注意了，为什么没有条带，请问引物设计还要注意什么？

回复此楼

» 猜你喜欢

1楼 2014-01-16 19:47:58

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

luochao2111

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1
红花: 1
帖子: 2
在线: 1.9小时
虫号: 615505
注册: 2008-10-01
专业: 植物生理与生化

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-01-28 22:46:01

我已经硕博五年级了，PCR做的非常多了。给你几点建议：
首先，确认一下你的引物是否有效，如果设计的引物不跨内含子的话，可以直接以基因组DNA做模板PCR一下（cDNA是由mRNA反转录的，mRNA的表达有组织特异性，同时还有因不同培养条件处理表达的选择性剪接差异。如果mRNA里都没有你的基因表达，那肯定是p不出来的）
其次，选取你的基因对应高表达的组织来提mRNA，反转录做模板。可以提高克隆成功的效率
最后，请确保PCR的引物、模板、buffer、dNTP、酶都是彻底混匀后添加，且添加顺序最好为ddH2O，buffer，dNTP，引物，模板，酶