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鸦米

新虫 (小有名气)


[交流] 用Nde1和Pst1双酶切,构载体总是不成功

选择的是Nde1和Pst1双酶切,37度,4h,酶切之后的质粒与没有酶切的跑胶,带不相同,但是无论是用普通方法还是用同源重组的方法都是做不出来,长的都是空载,连的片段也大,六百左右,求解。。。。。
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鸦米

新虫 (小有名气)


引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-07 11:24:01
你分析一下你的载体上的这两个酶的位点单一吗?不知道你用那公司的酶,有些酶具有星号活性,会切割非特异序列。

恩,后来看了一下,Nde1这个酶切位点可能有点问题,不过后来又用同源重组的方法做了一次,做出来了。谢谢啦
5楼2014-01-09 09:53:22
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鸦米(金币+1): 谢谢参与
无论是用普通方法还是用同源重组的方法都是做不出来,这的确很是费解

酶切之后的质粒与没有酶切的跑胶,带不相同,你这应该是双酶切的,有没有设置单酶切对照,建议你设置个单酶切对照,看看你手头上的两个酶是不是都有活力,万一当中有个酶失活了呢?
2楼2014-01-07 10:19:31
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)



鸦米(金币+1): 谢谢参与
你分析一下你的载体上的这两个酶的位点单一吗?不知道你用那公司的酶,有些酶具有星号活性,会切割非特异序列。
3楼2014-01-07 11:24:01
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鸦米

新虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-01-07 10:19:31
无论是用普通方法还是用同源重组的方法都是做不出来,这的确很是费解

酶切之后的质粒与没有酶切的跑胶,带不相同,你这应该是双酶切的,有没有设置单酶切对照,建议你设置个单酶切对照,看看你手头上的两个酶是不 ...

谢谢啦,昨天用同源重组的方法做出来了,实验室跑PCR的酶出问题才导致总是P不出来,不过这两个酶切位点我用普通的方法确实不好做,谢谢啦
4楼2014-01-09 09:52:16
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