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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 用Nde1和Pst1双酶切，构载体总是不成功
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鸦米

新虫 (小有名气)

[交流] 用Nde1和Pst1双酶切，构载体总是不成功

选择的是Nde1和Pst1双酶切，37度，4h,酶切之后的质粒与没有酶切的跑胶，带不相同，但是无论是用普通方法还是用同源重组的方法都是做不出来，长的都是空载，连的片段也大，六百左右，求解。。。。。
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1楼 2014-01-07 09:46:57
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)
★
鸦米(金币+1): 谢谢参与
无论是用普通方法还是用同源重组的方法都是做不出来，这的确很是费解

酶切之后的质粒与没有酶切的跑胶，带不相同，你这应该是双酶切的，有没有设置单酶切对照，建议你设置个单酶切对照，看看你手头上的两个酶是不是都有活力，万一当中有个酶失活了呢？
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2楼2014-01-07 10:19:31
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)
★
鸦米(金币+1): 谢谢参与
你分析一下你的载体上的这两个酶的位点单一吗？不知道你用那公司的酶，有些酶具有星号活性，会切割非特异序列。
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3楼2014-01-07 11:24:01
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鸦米

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-01-07 10:19:31
无论是用普通方法还是用同源重组的方法都是做不出来，这的确很是费解

酶切之后的质粒与没有酶切的跑胶，带不相同，你这应该是双酶切的，有没有设置单酶切对照，建议你设置个单酶切对照，看看你手头上的两个酶是不 ...

谢谢啦，昨天用同源重组的方法做出来了，实验室跑PCR的酶出问题才导致总是P不出来，不过这两个酶切位点我用普通的方法确实不好做，谢谢啦
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4楼2014-01-09 09:52:16
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鸦米

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-07 11:24:01
你分析一下你的载体上的这两个酶的位点单一吗？不知道你用那公司的酶，有些酶具有星号活性，会切割非特异序列。

恩，后来看了一下，Nde1这个酶切位点可能有点问题，不过后来又用同源重组的方法做了一次，做出来了。谢谢啦
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5楼2014-01-09 09:53:22
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