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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » red系统敲除用的感受态能放多久？同源臂太长会不会反而不好敲？
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liondolphin

银虫 (初入文坛)

[求助] red系统敲除用的感受态能放多久？同源臂太长会不会反而不好敲？ 已有2人参与

red重组系统中含有pkd46质粒的菌在加阿拉伯糖诱导后做成电转感受态，它在转线性片段之前能在-80冰箱里放多久呀？我敲的是大肠DH5a，同源臂搞了个两边各800bp的，结果转了2次，长了好多，结果就一个可能是我要的，是不是同源臂太长了的缘故？
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1楼 2014-01-03 17:22:32
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朱多龙

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liondolphin: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2014-01-05 11:04:59
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-05 15:17:25
一般存到负80是有什么问题的，关键你要是诱导表达那三个功能蛋白后再存可能就会有影响，最好还是诱导完做好感受态直接使用。还有就是同源臂的问题，在大肠里每端200bp足够了。太多了有时候会有其它位点重组的可能。
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2楼2014-01-03 17:37:06
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liondolphin

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 朱多龙 at 2014-01-03 17:37:06
一般存到负80是有什么问题的，关键你要是诱导表达那三个功能蛋白后再存可能就会有影响，最好还是诱导完做好感受态直接使用。还有就是同源臂的问题，在大肠里每端200bp足够了。太多了有时候会有其它位点重组的可能。

原来如此，看来不能偷懒啊，原本因为dh5a和bl21(de3)都要敲，所以按照bl21弄了个长的同源臂，结果就弄不好了

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-01-04 18:20:23
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bolysu

禁虫 (著名写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
4楼2014-01-05 10:18:57
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liondolphin

银虫 (初入文坛)
???????:
4?: Originally posted by bolysu at 2014-01-05 10:18:57
???BL21?ó?????

没有，长得好奇怪,电转???长了满???,稀释10000????涂????微好点

[ ????С??????? ]
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5楼2014-01-05 11:03:44
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liondolphin

银虫 (初入文坛)
???????:
5?: Originally posted by liondolphin at 2014-01-05 11:03:44
没有，长得好奇怪,电转???长了满???,稀释10000????涂????微好点
...

?????????Bl21??ó????pkd46????????????????????????γ????????????ζ?????????????10000?????е???????????????????
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6楼2014-01-05 17:07:57
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蝶影拂袖

银虫 (小有名气)
敲BL21的话同源臂是要很长的，五六百是要的~另外感受态最好新做，不然重组效率低，本来BL21就难做一些
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7楼2014-02-27 17:10:33
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沁荃

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by liondolphin at 2014-01-05 17:07:57
烦人的乱码，Bl21没敲成功，pkd46很难转进去，进去之后电转线性片段长得又很奇怪，每次都长成片，稀释了10000倍才有单菌落，都不知道是什么情况...

我用长同源臂敲BL21的基因也是长了一大片，但是挑了20多个菌都没有正确的是怎么回事啊~你遇到过这种情况么~谢谢~
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8楼2014-06-05 22:49:45
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