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真核生物的基因构建 已有3人参与
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| 请问能将一个质粒直接导入真菌中表达，而不是线性化后导入吗，直接导入会不会发生丢失，如果是要线性化导入的话，在18SrDNA处发生同源重组的话是不是会破坏18SrDNA的表达，使得真核生物不能生长? |
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4楼2013-12-30 18:31:11
2楼2013-12-30 16:20:27
luwei13566
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一般pPIC系列基本都是在5‘AOX1处和HIS4处重组，当然你的基因如果和酵母的基因组存在同源区段自然就会有其他区段的重组。 其实线性化并不是发生同源重组的必须条件，直接把环状质粒导入酵母也会发生重组，但是是随机重组，也就是说质粒上所有和酵母同源区段都会有发生重组的可能，而线性化只不过利用是通过内切酶切出了同源臂，而同源臂比其他区段相比更容易与酵母基因组上的相关区域发生单交换或者双交换事件~从而与酵母特定的区域发生重组。 如果你的质粒图谱上没有在酵母中稳定复制的复制起始位点的话，质粒自然不会单独传代，如果整合不上基因组就会随着酵母不断的扩增而丢失 你的质粒是什么质粒？是商品化的还是自己构建的？18SrDNA及其周围都属于菌株十分保守的区域，至少我没用过在18SrDNA整合的质粒~~~ |
3楼2013-12-30 16:35:36
luwei13566
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额，你真厉害，~~这个我做不来~~，要接这个题首先你肯定对裂殖壶菌的代谢和整个基因图谱非常清楚吧~~ 至于合适地方的选择，我觉得首先你构建质粒在宿主菌的特定位置上整合以后不能影响宿主菌最基本的代谢~不然宿主菌就没法长了。是不是可以在主要代谢以外的一些代谢分支上找一找看有没有大小合适而且在基因组上拷贝数不低的一些酶的基因来设计同源臂？就好比毕赤酵母的AOX1一样，整合上去不影响平常的代谢，只是在甲醇诱导的时候起效果~~ 其次，选择的整合位点对你以后阳性转化子的筛选有益~~比如说把宿主菌原有的同源区段替换后，宿主菌就出现了明显的差异，可以通过这个差异来进行筛选，就好比pPIC9K的组氨酸利用缺陷型筛选，和Mut+与MutS筛选一样~~~ 建议你把pPIC系列的质粒多研究研究，特别是这些质粒线性化位点的选择，肯定有帮助~~而且一定要多看看裂殖壶菌报道的文献，绝对有用！~ 毕竟我没做过，只能说说我自己的想法，希望对你有帮助~~  |
5楼2013-12-30 21:45:31
