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native-page活性染色 已有3人参与
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| 最近在做native-page活性染色，蛋白为木聚糖酶，理论上染色脱色后目的条带处应为无色且为单一条带，胶的其余部分应为红色。但是我做出来的结果是从点样孔到胶的三分之一处是无色的，而不是一条单一的条带，感觉目的蛋白是边跑边反应。（跑胶时是在冰浴中进行的）请问有没有这种边跑边反应的可能性啊？如何避免这种情况？ |
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7楼2014-01-06 21:00:14
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Native-page:12%分离胶配方(10ml):水 2.4ml，30%丙烯酰胺 4ml，1.5M pH8.8 Tris-HCl 2.5ml，10% APS 0.1ml，TEMED 0.004ml，1%木聚糖溶液（pH8.0 Tris-HCl配制）1ml 5%浓缩胶配方（5ml）：水 3.45ml，30%丙烯酰胺 0.83ml，1M pH6.8 Tris-HCl 0.63ml，10% APS 0.05ml，TEMED 0.005ml 5*Native-page上样buffer：1M pH6.8 Tris-HCl 1.25ml，溴酚蓝10mg，甘油2.5ml 刚果红染液：0.5g刚果红溶解到100ml 10%的乙醇中。 上样后80V50mA电泳至溴酚蓝前沿距胶1cm处，停止电泳。取出胶，浸泡在pH6.5柠檬酸-磷酸盐缓冲液（缓冲液是酶的最适反应缓冲液）中55度水浴30分钟，取出自来水冲洗两遍，加入刚果红染液染色30分钟，用1MNaCl溶液洗脱直至有清晰的条带出现。 电泳结果：1为原酶液，2酶液稀释10倍，3酶液稀释20倍，4酶液稀释50倍,5酶液稀释100倍 原酶液是由0.9%NaCl悬浮菌体超声波破碎后的上清液。 这次结果原酶液中跑出来一条带，但是跑不下来，溴酚蓝前沿已经跑到胶的最下面了。而且脱色后胶变成了黑色，以前用同样的方法染色脱色后胶布变黑，是红色的。   111.jpg |
9楼2014-01-07 12:11:05
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