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fengmx2010木虫 (著名写手)
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[求助]
利用gateway载体做RNAi和overexpression出现的问题，懂质粒构造的进！！！ 已有3人参与
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大家好，我现在想通过gateway技术构建一种基因的RNAi和Overexpression表达载体。Destination plasmid是从国外购买的，这两种载体的图谱如下。 我已经将目的基因通过带有attB1和attB2位点的引物克隆得到了。BP反应和LR反应已经做完了，依据致死基因和T-DNA外面链霉素抗性以及酶切验证，三个把关，我感觉目的基因已经导入到正确位置了。 现在的问题是，我将纯化好的质粒想导入发根农杆菌中，选择了A4（带有利福平抗性）和AT15834野生型（无任何抗生素抗性）两种菌株。可是怎么也筛不到阳性克隆，要么是污染，要么是什么都不长！我用的是链霉素（100ug/ml）和利福平（50ug/ml）平板，不知道是不是链霉素抗性基因不能在农杆菌中表达啊？卡那抗性能在农杆菌中表达吗？内含子之间的CmR又是在哪里表达的呢？我查了文献，但是还是一头雾水。关键是，有没有一种方法，可以从基因序列直接推理出它在某种菌内的表达情况？？  overexpression用  RNAi用，内含子之间有一cat基因，LB RB之间有一kana抗性基因。 |
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