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season131124

铁虫 (小有名气)

[求助] 多糖的分步醇沉已有2人参与

本人最近想用40%、60%、80%乙醇分步沉淀多糖,看文献中介绍醇沉前多糖溶液浓度最好是2%—5%,我想问一下,如果我的多糖经过脱蛋白后得到的浓缩液,不想冷冻干燥的话,该怎么确定醇沉前的多糖浓度呢?
   一般分步醇沉的操作是不是先将多糖溶液调整到合适浓度后,加入乙醇,使体系中乙醇终浓度是40%,4℃过夜后,抽滤得到多糖沉淀,然后将上清液继续加入乙醇,使体系中乙醇终浓度达到60%,一般怎么计算要加入的乙醇体积呢?在计算的过程中要不要减掉前面加入的乙醇的体积?
    请问一般做分步醇沉的得率怎么样?会不会出现某一个浓度乙醇沉淀的多糖特别多,另一个特别少呢?
   

   请各位大神赐教,本人将感激不尽~~~~
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pjn403403

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1、你可以取少量的浓缩液去做冷冻干燥,不干燥成固体测溶液中多糖的浓度有点麻烦,首先你得摸清楚你的浓缩液稀释到多少倍后用硫酸苯酚法测得的吸光度在0.3~0.7之间,然后再配相应浓度的葡萄糖溶液。
2、你说的就是分步醇沉的方法,测乙醇浓度可以用酒精计,或者自己算,自己算你得先清楚你所用的乙醇的浓度,无水乙醇好算一点,95%的乙醇稍微麻烦些,但都不是问题。料液中乙醇的终浓度
C=加入乙醇前溶液体积V1*加入乙醇前溶液乙醇浓度C1+所加入的乙醇体积V2*所加入的乙醇浓度C2/V1+V2,那按这个公式就能算出你想要的东西。
3、多糖是由不同数量的单糖按不同的序列聚合起来的,分子量分布很广,而分子量与多糖的溶解性密切相关,所以分步醇沉出来的多糖肯定会有多有少,这是很正常的现象。
从事中药相关工作,希望和大家多交流
2楼2013-12-19 13:55:17
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season131124

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by pjn403403 at 2013-12-19 13:55:17
1、你可以取少量的浓缩液去做冷冻干燥,不干燥成固体测溶液中多糖的浓度有点麻烦,首先你得摸清楚你的浓缩液稀释到多少倍后用硫酸苯酚法测得的吸光度在0.3~0.7之间,然后再配相应浓度的葡萄糖溶液。
2、你说的就是 ...

恩,我明白你的意思了。其实我第一步测多糖含量的目的是为了将多糖浓缩液调到合适的浓度进行后面的分步醇沉。我做预实验的时候发现,最初始的多糖浓度调的不合适,40%醇沉时大部分多糖已经沉淀下来了,等到60%已经很少了,80%几乎没有沉淀。所以我现在不知道该如何去调初始的多糖浓度。
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3楼2013-12-19 15:18:07
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pjn403403

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by season131124 at 2013-12-19 15:18:07
恩,我明白你的意思了。其实我第一步测多糖含量的目的是为了将多糖浓缩液调到合适的浓度进行后面的分步醇沉。我做预实验的时候发现,最初始的多糖浓度调的不合适,40%醇沉时大部分多糖已经沉淀下来了,等到60%已经 ...

其实初始的多糖浓度越稀越好,太稀的唯一缺点就是浪费乙醇。如0.01%~0.1%对你分步醇沉的收率几乎无影响,但是5%~10%对你分步醇沉的收率影响就大了,这里有一个临界值需要你去摸索,如果你不想摸的话就弄一个足够稀的去分步醇沉吧
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4楼2013-12-19 16:27:39
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pjn403403

木虫 (小有名气)

顺便问一下你是用什么方法出蛋白的,用什么方法过滤的
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5楼2013-12-19 16:29:35
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season131124

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by pjn403403 at 2013-12-19 16:29:35
顺便问一下你是用什么方法出蛋白的,用什么方法过滤的

我用的是Sevag法脱蛋白;我提取的时候是趁热纱布过滤的,后面醇沉的时候就是抽滤的了
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6楼2013-12-19 19:26:50
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pjn403403

木虫 (小有名气)

Sevag法脱蛋白很麻烦吧,我以前用过,正在找一个更好的方法。纱布过滤完,液体也不是很澄清吧
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7楼2013-12-19 20:50:10
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season131124

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by pjn403403 at 2013-12-19 20:50:10
Sevag法脱蛋白很麻烦吧,我以前用过,正在找一个更好的方法。纱布过滤完,液体也不是很澄清吧

是很麻烦,关于脱蛋白,我不想去仔细折腾了,所以就按照文献上的多花点时间搞了。我一般过完纱布后,还要再离心的。
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8楼2013-12-19 21:34:26
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小糊涂虫虫

至尊木虫 (职业作家)

引用回帖:
4楼: Originally posted by pjn403403 at 2013-12-19 16:27:39
其实初始的多糖浓度越稀越好,太稀的唯一缺点就是浪费乙醇。如0.01%~0.1%对你分步醇沉的收率几乎无影响,但是5%~10%对你分步醇沉的收率影响就大了,这里有一个临界值需要你去摸索,如果你不想摸的话就弄一个足够稀 ...

请教一下,初始多糖浓度高时对醇沉有什么影响?
ChanceonlyFavorsthePreparedMind~~~PennyWise,PoundFoolish~
9楼2015-01-30 21:52:42
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pjn403403

木虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 小糊涂虫虫 at 2015-01-30 21:52:42
请教一下,初始多糖浓度高时对醇沉有什么影响?...

会影响收率,影响所得多糖的分子量分布,最严重的可能对产物的活性都会有一定的影响
从事中药相关工作,希望和大家多交流
10楼2015-01-31 08:56:53
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