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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » gateway克隆B序列末端家不叫A
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fanwq258

木虫 (正式写手)

[交流] gateway克隆B序列末端家不叫A

如题，要做gateway克隆，不知道普通的加A TAQ酶能不能用，还有就是必须的是25bp吗？有的文章中在25bp基础上加了个GGGG是什么意思？

[ Last edited by fanwq258 on 2013-12-2 at 12:06 ]
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1楼 2013-12-02 11:50:45
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伤何处

木虫 (正式写手)
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-06 14:39:59
加上4个G，好像是提高重组反应的效率。我一般短片端用的Ex Taq酶，长片段用的高保真的酶，都能成
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2楼2013-12-02 16:47:32
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 伤何处 at 2013-12-02 16:47:32
加上4个G，好像是提高重组反应的效率。我一般短片端用的Ex Taq酶，长片段用的高保真的酶，都能成

有人告诉我设计引物时在
上游引物：CACC+目的基因
下游：目的基因
怎么回事啊，都不需要B序列吗？
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3楼2013-12-03 11:56:58
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伤何处

木虫 (正式写手)
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fanwq258: 金币+5 2014-04-01 19:45:18
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3楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-12-03 11:56:58
有人告诉我设计引物时在
上游引物：CACC+目的基因
下游：目的基因
怎么回事啊，都不需要B序列吗？...

这个是TOPO克隆的，需要TOPO酶。加attB是用来做BP反应的，需要BP重组酶   两种都是构建entry载体的方法
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4楼2013-12-03 15:35:57
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fanwq258

木虫 (正式写手)
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4楼: Originally posted by 伤何处 at 2013-12-03 15:35:57
这个是TOPO克隆的，需要TOPO酶。加attB是用来做BP反应的，需要BP重组酶   两种都是构建entry载体的方法...

那我还得买个TOPO酶了啊，还得bp反应试剂盒，lr反应试剂盒？
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5楼2013-12-03 15:56:55
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伤何处

木虫 (正式写手)
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-09 21:01:17
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5楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-12-03 15:56:55
那我还得买个TOPO酶了啊，还得bp反应试剂盒，lr反应试剂盒？...

看你目的了，目的载体上如果是attR位点的话，那就要买TOPO或者BP中的一个，再加一个LR。如果载体上是attP位点，那就只要TOPO或者BP中的一个，不需要LR
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6楼2013-12-03 19:44:57
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434744419

金虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-12-03 11:56:58
有人告诉我设计引物时在
上游引物：CACC+目的基因
下游：目的基因
怎么回事啊，都不需要B序列吗？...

如果加CACC 就不需要B序列。主要是看你选择什么样的入门载体，不过无论哪种，都是invitrogen的。我以前做过，就是加的CACC.比加B序列方便。
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7楼2013-12-04 08:32:17
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 伤何处 at 2013-12-03 19:44:57
看你目的了，目的载体上如果是attR位点的话，那就要买TOPO或者BP中的一个，再加一个LR。如果载体上是attP位点，那就只要TOPO或者BP中的一个，不需要LR...

反应体系为:
组分                   使用量
PCR产物                   2.0 μl
Salt solution         0.5 μl
pENTR D-TOPO 载体         0.5 μl
总体积                   3.0 μl
　　于22.5℃过夜连接反应。
那请问这个算什么反应呢？有人跟我说是BP反应，但是没用酶啊，有TOPO载体
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8楼2013-12-05 12:31:11
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jasco

木虫 (正式写手)
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4楼: Originally posted by 伤何处 at 2013-12-03 15:35:57
这个是TOPO克隆的，需要TOPO酶。加attB是用来做BP反应的，需要BP重组酶   两种都是构建entry载体的方法...

这个是正解
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9楼2013-12-05 13:03:45
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fanwq258

木虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by 434744419 at 2013-12-04 08:32:17
如果加CACC 就不需要B序列。主要是看你选择什么样的入门载体，不过无论哪种，都是invitrogen的。我以前做过，就是加的CACC.比加B序列方便。...

那你能够具体给我说一下怎么做吗？我的载体是attR位点的
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10楼2013-12-05 15:42:02
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伤何处

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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10楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-12-05 15:42:02
那你能够具体给我说一下怎么做吗？我的载体是attR位点的...

我发给你个ppt看看吧，其实你可以百度下的 网上有很多介绍gateway技术的
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  • 附件 1 : Gateway_载体构建.ppt
    • 2013-12-05 16:31:44, 417.5 K
11楼2013-12-05 16:32:19
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伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-12-05 12:31:11
反应体系为:
组分                   使用量
PCR产物                   2.0 μl
Salt solution         0.5 μl
pENTR D-TOPO 载体         0.5 μl
总体积                   3.0 μl
　　于22.5℃过夜连接反应。
那请问这个算什么反应呢？ ...

你用TOPO载体那肯定是TOPO反应，酶的话已经在试剂里面，但没标出来 。体系跟我之前做的是一样的
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12楼2013-12-05 16:34:05
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fanwq258

木虫 (正式写手)
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12楼: Originally posted by 伤何处 at 2013-12-05 16:34:05
你用TOPO载体那肯定是TOPO反应，酶的话已经在试剂里面，但没标出来 。体系跟我之前做的是一样的...

请问，我现在实验室就只有gateway的表达载体，其他东西都的买，哪种方法可以最省钱呢？
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13楼2013-12-05 18:24:05
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fanwq258

木虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by 434744419 at 2013-12-04 08:32:17
如果加CACC 就不需要B序列。主要是看你选择什么样的入门载体，不过无论哪种，都是invitrogen的。我以前做过，就是加的CACC.比加B序列方便。...

请问，我现在实验室就只有gateway的表达载体，其他东西都的买，哪种方法可以最省钱呢？
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14楼2013-12-05 18:24:49
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伤何处

木虫 (正式写手)
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fanwq258: 金币+5 2013-12-05 21:39:21
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13楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-12-05 18:24:05
请问，我现在实验室就只有gateway的表达载体，其他东西都的买，哪种方法可以最省钱呢？...

买TOPO的话它里面就有TOPO载体了，买BP的话好像试剂盒里面没有pDONR221载体。具体你还是问你们那的Invitrogen公司销售代理吧，他会给你建议的
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15楼2013-12-05 19:53:26
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fanwq258

木虫 (正式写手)
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15楼: Originally posted by 伤何处 at 2013-12-05 19:53:26
买TOPO的话它里面就有TOPO载体了，买BP的话好像试剂盒里面没有pDONR221载体。具体你还是问你们那的Invitrogen公司销售代理吧，他会给你建议的...

好的 谢谢你告诉我这么多
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16楼2013-12-05 21:38:54
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fanwq258

木虫 (正式写手)
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15楼: Originally posted by 伤何处 at 2013-12-05 19:53:26
买TOPO的话它里面就有TOPO载体了，买BP的话好像试剂盒里面没有pDONR221载体。具体你还是问你们那的Invitrogen公司销售代理吧，他会给你建议的...

再请教一个问题，gateway克隆会产生移码突变吗？用TOPO反应的话，引物设计需要注意什么吗？
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17楼2013-12-05 21:55:47
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伤何处

木虫 (正式写手)
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17楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-12-05 21:55:47
再请教一个问题，gateway克隆会产生移码突变吗？用TOPO反应的话，引物设计需要注意什么吗？...

TOPO反应的话，只要在正向引物的5'端加CACC就行了吧，不记得有什么特别需要注意的  我没用过gateway构建过表达载体，正在构建启动子+gus的，这个的话只要注意gus不发生移码就成
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18楼2013-12-05 22:01:17
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434744419

金虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-12-05 18:24:49
请问，我现在实验室就只有gateway的表达载体，其他东西都的买，哪种方法可以最省钱呢？...

要是topo反应的需要买试剂盒，大约4k,以后做LR需要买克隆酶，大约2k多！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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19楼2013-12-09 20:42:46
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