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[求助]
一直扩增不了目标产物，求助
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求助各位大侠，本人开始课题已经8个月了，一直得不到目的基因，请各位给点建议，多谢了。 先介绍一下我的课题，我要扩增的是虾夷扇贝的一个基因，目前在NCBI数据库中只能找到海湾扇贝的这个基因，没有其他扇贝数据。 用海湾扇贝，牡蛎，蛤类，贻贝等贝类设计不出引物，如果设计兼并引物的话简并度很高，20bp的引物至少需要6个位置兼并，剔除海湾扇贝后设计了很多引物，都扩增不了。后来把海湾扇贝加进去，只能设计一个兼并引物，用这个兼并引物的正向和反向引物和marathon 试剂盒的AP1一起扩增（cDNA是marathon cDNA），得到的条带很弱，切下条带后用同样的引物做二次PCR，得到很亮的条带，切胶回收后subcloning，挑了很多菌落测序，得到的序列能够找到目标引物和AP1，但把这个序列blastn后却没有相似性。 我很怀疑我得到的序列是不是目的基因，到底是新序列还是非特异性扩增，该如何确认？ 我扩增了这么久，得不到目的产物，也很难找到靠谱的引物，该如何改进策略，从蛋白入手还是建phage cDNA文库，建了文库后如果用海湾扇贝的cDNA抗体来筛选把握大不大？ 该如何预判我的目标基因到底在虾夷扇贝中表达不表达？是不是我的目标产物根本不表达（从文献中看各种物种都普遍表达）？ 请各位高手给点建议，多谢了。 [ Last edited by garonne on 2013-11-26 at 14:50 ] |
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