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[求助]
定点突变蛋白质不表达已有1人参与
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| 近期，做了几个点的定点突变，突变点是通过软件模拟得到的。通过突变，转化发酵，结果突变体没有酶活。突变体DNA测序表明突变正确，没有移码。但未能找到不表达的原因，向各位求助，指点一下何种原因导致不表达，谢谢。 |
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【答案】应助回帖
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xdfy0301: 金币+4 2014-04-27 23:26:30
xdfy0301: 金币+4 2014-04-27 23:26:30
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分析原因其实是个很麻烦的事情 像你的这种情况，比较可能的是 1.你的蛋白表达量低了，被内源条带遮盖，你可以尝试纯化一下看看，或者按楼上的建议跑一下western 2.你的蛋白突变后导致折叠问题，比如折叠出错或者变慢，导致疏水区暴露，或者在折叠某一时段暴露，然后被内源的蛋白酶系统降解 3.你突变后改变了mRNA的二级结构或稳定性，导致核糖体结合mRNA困难，或者mRNA快速降解。针对这种情况，你可以用同义密码子替换一下突变位点（或附近）的碱基，看看有没有效果 小概率的原因 4. 你突变后的位点是内源蛋白酶的识别位点 5. 如果你使用的是试剂盒进行突变（过程中复制了整个质粒），那么运气不好的话，在转录区域，RBS区域等发生突变，导致转录困难。 建议你用同义密码子突变替换一下现有的突变，如果还是不表达的，换一下突变位点的氨基酸类型 如果更换密码子有效果，问题可能在mRNA方面 如果更换氨基酸残基类型有效果，那么问题可能在折叠或构象方面 |
12楼2014-04-14 11:14:42
2楼2013-11-22 20:40:22
3楼2013-11-23 16:31:26
4楼2013-11-23 19:31:00