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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 化学分析 » AKAT 蛋白纯化仪 分离纯化相关问题求助
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edmundcui

新虫 (初入文坛)

[求助] AKAT 蛋白纯化仪 分离纯化相关问题求助 已有2人参与

第一次注册小木虫，不知道来这个版发帖对不对？还望有人支持下哈，废话不熟了
我的目的是分离纯化活性物质，上样的样品是硫酸铵沉淀的蛋白粗样，等电点，分子量啥都不知道，过了DEAE柱子，缓冲液是tris-HCL，pH8.1,和1M的NaCl，pH8.1.最后活性检测发现100%流出的那个组分峰是我要的物质，再过CM柱，只有在非吸附那里有一个峰，跑SDS-PAGE，也分不开，求助各位怎么优化这个方法？或者有其他的建议也好？
AKAT 蛋白纯化仪 分离纯化相关问题求助
pc3-30%-DEAE-pc3-30%-DEAE-third.jpg
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1楼 2013-11-19 23:40:46
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wujun225

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

从你的位置来看，应该是目的蛋白吸附太牢，你可以试试降低pH值1到2个单位再试试。过阳离子柱分不开只能是杂蛋白等电点相近，不只跑电泳带之间是否很近，如果很近的话说明分子量差不多，等电点差不多，可以用疏水柱子如phenyl hp试一试。如果很远的话说明分子量差很多，可以用superdex试一下。
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内敛低调
5楼2013-12-08 21:55:25
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cpn

木虫 (正式写手)
乙腈，针对蛋白类。。
不加TFA或FA，蛋白或多肽的保留会很差，在反相柱上。
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11楼2014-01-07 15:26:34
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普通回帖

lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
感谢参与，应助指数 +1
你可以先去生物科学板块发帖，然后我可以告诉你把你的目的蛋白的等电点弄清楚了在来发帖，要不谁也帮不了你
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2楼2013-11-20 08:44:34
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edmundcui

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lihuan0525 at 2013-11-20 08:44:34
你可以先去生物科学板块发帖，然后我可以告诉你把你的目的蛋白的等电点弄清楚了在来发帖，要不谁也帮不了你

因为它是未知的混合物，如何知道等电点？知道了它的等电点也不一定就是目的物质的吧？
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3楼2013-11-20 08:53:42
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lihuan0525

金虫 (职业作家)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by edmundcui at 2013-11-20 08:53:42
因为它是未知的混合物，如何知道等电点？知道了它的等电点也不一定就是目的物质的吧？...

知道了等电点才能进一步明确怎么纯化
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4楼2013-11-20 10:41:59
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edmundcui

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wujun225 at 2013-12-08 21:55:25
从你的位置来看，应该是目的蛋白吸附太牢，你可以试试降低pH值1到2个单位再试试。过阳离子柱分不开只能是杂蛋白等电点相近，不只跑电泳带之间是否很近，如果很近的话说明分子量差不多，等电点差不多，可以用疏水柱子 ...

嗯，我试试看，跑胶条带相差大，10K下方总是一坨，几十K的也有条带，我用这个100%洗脱的样品过制备RP-HPLC，甲醇：水体系，梯度洗脱效果也不理想，像是完全没有吸附到C18柱上边。
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6楼2013-12-11 15:16:50
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wujun225

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by edmundcui at 2013-12-11 08:16:50
嗯，我试试看，跑胶条带相差大，10K下方总是一坨，几十K的也有条带，我用这个100%洗脱的样品过制备RP-HPLC，甲醇：水体系，梯度洗脱效果也不理想，像是完全没有吸附到C18柱上边。...

额，一般多肽可以过RP-HPLC，你那个蛋白这样过的话估计变性了。你过阴离子交换柱可以降低pH，然后过superdex试试
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内敛低调
7楼2013-12-14 18:39:17
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edmundcui

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wujun225 at 2013-12-14 18:39:17
额，一般多肽可以过RP-HPLC，你那个蛋白这样过的话估计变性了。你过阴离子交换柱可以降低pH，然后过superdex试试...

谢谢， 好的，我也是觉得过液相效果不好，1m氯化钠洗脱下来的，估计也有这个原因吧？目前没有凝胶柱，还要买才行

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2013-12-14 23:04:29
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cpn

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

lz你这10k以上的蛋白，过C18效果不好吧，蛋白一般用C4，C8会好一些。。。而且一般也不用甲醇当流动相，用乙腈-水体系，加TFA效果会比较好。
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9楼2013-12-15 12:41:04
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edmundcui

新虫 (初入文坛)
嗯，我看了相关一些文献，10k以下的脂肽用C18纯化出来了，几十k的较少，流动相的话楼上的意思是乙腈优于甲醇，是针对蛋白类说？还是整体的说？

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10楼2013-12-16 23:46:44
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