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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原来表达目的蛋白的菌株现在怎么不表达了？
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574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] 原来表达目的蛋白的菌株现在怎么不表达了？

去年构建的重组蛋白脂肪酶，载体是pET28b，表达菌是BL21(DE3)诱导时O，D600为0.6左右加入IPTG，诱导4h和20h取样做SDS-PAGE电泳。去年表达时蛋白没有问题，今年重新构建了一个蛋白发现不表达，于是拿出去年的脂肪酶做正对照，发现正对照也表达不出蛋白了，自己分析原因如下：
1、菌体中载体丢失
菌体在Kan环境中能生长，排除了这种可能，下一步做一下菌落PCR进一步确定一下。
2、IPTG失效
开始用的是一年前配制好的，放在-20℃冰箱的，后来用粉末重新配的还是不行，我的粉末是到今年12月份过期，不知道是不是这个原因？
3、所用其他试剂都是新配制的，而且应该也不会导致蛋白不表达吧，SDS-PAGE电泳所用试剂就是个载体，应该没什么影响吧？
    有哪位能帮忙分析一下或遇到这个问题，怎么解决的？先谢谢了
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1楼 2013-11-14 16:23:27
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574759350

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jennifermatt at 2013-11-15 10:57:00
重新转化吧。甘油菌保存时，浓度过高很容易丢失。

是容易丢失质粒还是目的基因？
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5楼2013-11-15 11:09:18
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gyesang

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【答案】应助回帖

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574759350: 金币+2 2013-11-15 11:08:28
你分析的原因都是有可能的，实验失败哪一个环节都可能是问题所在，还有，最好做正对照脂肪酶的表达，重新转化下，不要用甘油菌
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-11-14 23:04:51
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jennifermatt

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
574759350: 金币+2 2013-11-15 11:08:38
重新转化吧。甘油菌保存时，浓度过高很容易丢失。
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求是
3楼2013-11-15 10:57:00
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574759350

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-14 23:04:51
你分析的原因都是有可能的，实验失败哪一个环节都可能是问题所在，还有，最好做正对照脂肪酶的表达，重新转化下，不要用甘油菌

但是如果能在含kan的平板上生长能说明质粒没丢失吧？
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4楼2013-11-15 11:08:22
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